Всесоюзный кардиологический научный центр AMH СССР н Всесоюзный научно-.исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медицинского назначения (7.1) Заявители (54) .СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОГО

ФИБРИНОЛИЗИНА

Изобретение относится к области химии полимеров и химикофармацевтической промышленности, а именно к способу получения иммобилизованного фибринолизина, обладающего пролонгированной тромболитической активност ью.

Фибринолизин широко применяют в. медицине в качестве тромболитического препарата при терапии таких заболеваний как инфаркт миокарда, тромбозы, тромбоэмболии легочных артерий, Препарат вводят внутривенно в течение нескольких дней. Однако терапия фибринолизином осложняется следующими 15 обстоятельствами. Во-первых, фибринолизин не обладает субстратной специфичностью. Он гидролизирует не только фибрин, но и другие белки: фибриноген, казеин и некоторые белки свертываккцей системы крови. Во-вторых, применение фибринолизина может вызывать не только повьиаение фибриноли тической активности, но активацию свертывающей системы, в результате 25 чего возможно повторное возникновение тромбов. В-третьих, как и все ферментные препараты, фибринолизин быстро инактивируется в физиологических ус- ловиях под действием рН, температуры, 30. эндогенных протеаз и природных ин-. гибиторов и быстро выводится из кровотока, что приводит к необходимости введения больших доз фермента в тече-. ние продолжительного времени. При этом безуспешным оказалось лечение больных со значитеЛьными размерами тромбов, а также с низкими антикоагулянтными показателями крови.

В настоящее время известно, что во многих случаях связывание ферментов с растворимыми биосовместимыми полимерами позволяет получать препараты, обладакицие по сравнению с нативными ферментами более высокой стабильностью по отношению к различным .инактивирующим воздействиям, замедленным выведением из организма и пониженной антигенностью.

Известен способ получения. иммобилизованного .фибринолизина путем ковалентного связывания фибринолизина с сополимером этилена и малеинового ангидрида P1)

Недостатком этого способа является несовме стимость иммобилизов анного фибринолизина с тканями живого организма, поскольку сополимер этилена с малеиновым ангидридом не является. биор аз л агаемым.

1002356

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым результатам является способ полученйя иммобилизованного фибринолизина путем ковалентного связывания фибринолиэиНа с альдегидсодержащим полисахаридом 5 при рН 8,0-9,5 при 8-30" C (2), B качестве .альдегидсодержащего поли сахар ида и спол ьз уют ал ьде гидсе фадекс и коналентное связывание приводят в фосфатном буфере в течение нескольких часон.

Недостатком этого способа является нерастворимость иммобилизованного фиб ринолизина в воде и водных растворах.

Целью изобретения является получе- 15 ние водорастноримых препаратов иммобилизованного фибринолизина.

Цель достигается тем, что в способе иммобилизонанного фибринолизина путем ковалентного связывания фибри- 20 нолизина с альдегидсодержащим полисахаридом при рН 8,0-9,5 при 8-30 С н качестве альдегидсодержащего полисахарида используют диальдегиддекстран с молекулярной массой 20000-110000, 25 а иммобилизованный фибринолизин дополнительно восстанавливают боргидридом натрия.

Исходный ди аль гедде к стран получают окислением декстрана йодной кисло- 3(3 той или ее натриевой солью. Иммобилизованный фибринолизин отделяет от избытка минеральных солей деминералиэацией на мембранах, в частности деалиРаствор TIQJ1$ LeHHoro препарат а лиофилиз ируют . продукт полностью сохраняет биологическую активность.

Пример 1. Растнор 1 г диальдегиддекстрана с молекулярной массой

20000 в 20 мл дистиллированной воды смешивают со 110 мл 0,2 M содового . раствора (рН 9,5) и к раствору добавляют при легком перемешивании 6,5 r фибринолизина.

Реакционную смесь в объеме 130 мл выдерживают при рН 9,5 при 30 С 1 ч, затем охлаждают до 10т1 С и добавляют

40 мл 0,5%-ного растнора боргидрида натрия в содовом буфере с рН 8,5, охлажденного до 10+1 С. Реакцию восста- 50 новления проводят 30 мин при рН 8,59,0.

Раствор иммобилиэонанного фибринолизина разливают в целлофановые мешки

/ два мешка по 85 мл и диализуют при 55 температуре 6+2 С против 17 л дистиллированной воды в течение 24 ч. Диализованный раствор иммобилизованного фибринолизина разбавляют апирогенной водой до 350 мл, пропускают через 6О стерильный фильтр (диаметр пор

0,22 мкм) и высушивают лиофильно.

Выход препарата составляет 2275 мг.

Удельная фибринолитическая активность равна 21,2 ед/мг препарата общей активностью 47230 ед., что составляет

31,0% от исходного. Полученный продукт представляет собой пористую массу белого цвета беэ запаха, без вкуса. Препарат гигроскопичен, растнорим в воде и в 0,9%-ном изотоническом растворе натрия хлорида, практически нерастворим в 95%-ном спирте, эфире, хлороформе.

Пример 2. Раствор 8 r диальдегиддекстрана с молекулярной массой

110000 в 150 мл дистиллированной воды смешивают с 425 мл содового буферного раствора с рН 8,0. Полученный раствор смешивают с раствором нативного фибринолизина, приготовляемого растворением 45 r фибринолизина в

425 мл дистиллированной воды.

Реакционную смесь в объеме 1000 мл выдерживают при температуре 8,0 1 С

40 мин и добавляют 310 мл охлажденного до. температуры 6+2ОC раствора боргидрида натрия, получаемого растворением 1,5 r боргидрида натрия н 310 мл

0,1 М содового буферного раствора с рН 8,5. Реакцию восстановления проводят 30 мин. Затем раствор иммобилизованного фибринолизина ставят на диалиэ против дистиллированной воды в соотношении диализуемый раствор: вода

1 : 150 на 24 ч при 4-7 С и высушивают лиофильно. Выход препарат составляет 12,5 r с удельной активностью

24 ед/мг и общей активностью 300000 ед, что составляет 30% от исходного.

Полученный продукт представляет собой порошок с желтоватым оттенком без запаха, без вкуса. Препарат гигроскопичен, легко растворим в. воде и 0,9%-ном изотоническом растворе натрия хлорида практически нераство- рим в 95%-ном спирте, эфире., хлороформе.

Изучение специфического (тромболитического) действия иммобилизованного фибринолизина проводят на моделях тромбозов яремной вены кролика и бедренной вены или артерии собаки. У указанных выше животных формируют тромбы размером от 1 до 2,5 см, полностью облитерирующие просвет кровеносного сосуда. Введение испытуемого препарата на фоне гепарина начинают через 1 ч после образования тромба.

Дозу препарата (от 400 до 4000 ед, на кг веса) растворяют в физиологическом растворе для кроликов в 2030 мл, а для собак в 50-100 мл и вводят шприцем на протяжении 20 мин внутривенно струйно, а не по инструкции по применению фибринолизина (внутривенно вЂ” капельным методом со скоростью 10-12 капель в минуту). . Динамику образования и лизиса тромба наблюдают визуально и пальпаторно на протяжении 6 ч опыта через одни, двое и трое суток . Ангиографию

1002356

Доза препарата на кг веса, ед, Испытуемый препарат

Количество животных

Группа жи вот ных

600

Лизиса нет

Лизис полный

Лиэиса нет

Лиэис полный

Кролики

Фибринолизин

800

Кролики

800

1200

Лизис полный

2000

4000

Иммобилизованный фибринолизин

400

Лизис полный

600

800

Лизиса нет

Фибринолизин

Собаки

800

Лиэиса нет

Лиэис полный

1600

Лизис полный

1600

Иммобилизован-ный фибринолизин 3

Лиэис полный

Лиэис полный.

600

600 и флюометрию проводят до начала лечения и через сутки после введения препарата.

Из экспериментальных данных следует, что лечение фибринолизином кроликов не дает тромболитического эффекта во всех случаях применения минимальной лечебной дозы (800 ед/кг) .

При этом наблюдается кровоточивость, патологические изменения в третьей фазе свертывания крови, падение содержания фибриногена в первые часы подле введения до О. Увеличение дозы до 4000 ед/мл вызывают гибель животного от фибринолиэина. 8 отличие от нативного фибринолизина лечение иммобилизованным фибринолиэином более эф-60 фективно даже при применении минималь ной терапевтической дозы в 400 ед/кг.

Кроме того, фибринолитическое действие иммобилизованного фибринолизина наблюдается длительное время вЂ” до

Результаты изучения тромбОлитической активности иммобилизованного фибринолиэина представлены в табл.1.

Та блица 1

Эффективность терапии (лизис тромба) Лизис полный (погиб от кровотечения) двух суток после введения. Препарат не вызывает резких изменений в третьей фазе свертывания крови. и в связи с этим лечение не сопровождается кровотечением.

Токсичность иммобилизованного. фиб-. ринолизина в острых опытах изучают на белых мяшах, крысах, кроликах и собаках (см. табл.2). Полученные результаты показывают, что ЛД, различных партий иммобилизованного фибринолиэина колеблется в сравнительно небольших пределах от 5000 до 6000 ед/кг.

Токсичность иммобилизованного фибринолиэина оказалась сходной.с токсичностью нативного фибринолизина. Однократное введение животным иммобилизованного фибринолизина в дозах, в

4-5 раз превышающих терапевтическую, 1002356

Таблица 2

Токсичность иммобилизованного фибринолиэина для животных разных видов при внутривенном введении

Дозы, ед/кг, и результаты опытов

1! j 1

ЛДр) г ед/кг

Вид животных

Число животных

500 1000 1500 2000 2500 3750 5000 6250

2/4 6/О 500О

3/3 6/О 4586

О/6 0/6 1/5

О/6 0/6 2/4

Мыши 34

Крысы 30

Кроли ки 30

Собаки 7

О/6 1/5 2/4 2/ 6/О

1834

О/3 О/3 О/1

Формула изобретения

Составитель Л. Валуев

Редактор О. Юркова Техред М.Тепер Корректор М. Коста

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, %-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 1728/10

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул; Проектная, 4 ие вызывает их гибели. В исследованных дозах препарат не обладает повреждающим действием на сосуды и не вызывает никаких макро- и микроскопичесТаким образом, изобретение позволяет получать.водорастворимые препараты иммобилиэованногО фибринолизина, обладающие пролонгированной тромболитической активностью.

Способ получения иммобилиэованного фибринолизина путем ковалентного связывания фибринолизина с альдегидсодержащим полисахаридом при рН 8,09,5 и при 8-30 С, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что, с целью получения водораствориьых препаратов иммобилизованного фибринолизина, в качестве аль » ких изменений внутренних органов. В ,терапевтических дозах он не оказывает действие на центральную нервную систему и кровяное давление. дегидсодержащего полисахарида испольруют диальдегиддекстран с молекулярной массой 20000-110000, а иммобилиэованный фибринолиэин дополнительно восстанавливают боргидридом натрия.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Fritz Н, et al, Nach Weis und

preparative Trennung von Proteinase inhibltoren und чоп proteinasen mit

Hiffe Wasserunlos!icher Enzym-bzw,â€”

lnh lb ltorha rse, 1968, т, 243, 9 2, с. 452-463.

2. Чазов Е.И. и др. Экспериментальное изучение биорассасывающихся препаратов.- Кардиология, 1977, 9 11, с. 139-142 (прототип).