Стабилизированная урокиназа,обладающая тромболитической активностью,и способ ее получения

 

1. Стабилизированная урокиназа . рбыей формулы тЛ-то1-То где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20% NH-T урокиназа, обладающая тромболитйческой активностью . 2. Способ получения стабили.зи« рованной урокиназы по п. 1, о т л ич .аюцийся тем, что урокиназу при, температуре 0-25 С и рН В,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акрило-вой кислой с молекулярным весом 10-200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварите тьно обработанным карбодиимидом.

„.SU„„ 1022988 A

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИН.МЮ С 12 N 9/72, С 12 N 11/10// .А 6 3.

Д/ ! !

ОПИСАНИЕ ИЗ05РЕТЕИИЯ

H A8TOPCH0MY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОМНРЫТИЙ (21) 2821712/23-04 (22) 28. 09.79 .(46). 15.06.83. Вюл. В 22 (72) A.Â. Максименко, В.П. Торчилин, В.Н. Смирнов и Е,И. Чазов (71) Всесоюзный кардиологический научный центр ANH СССР 53) 577.15;07(088.8) (56) 1. Capet-Antonini. F.Ñ., Tamenasse J., Kinetic Studies an SoIubIe and.InsoIubIe Urokinases, Can. J.

Biochem,. 53,(1975), 890-894.

2. Martensson К., _#_osbach К., CovaIent CoupIing of PuI&Ianase

to an AcryIic CopoIymer Using a

jWater SoIub Ie Carbodi- Imide. BiotechnoI Bioeng, 1972, 14, 715-724.

3. TorchiIin .V.P., Tischqnko Е.G., .Smirnov Ч.N., CovaIent Ьпийй 111заtion of Ensymes on 1опоцепП: Сатriers. Effect of EIectrostatic .Complex Formation Prior to Immobi1ij

sation. - J. SoIid-.Phase Biochem, 1977, 1, Р 1, 19- Ъ. (54) CTABHJIHBHPOBAHHAR УРОКИНАЗА, ОБЛАДИЯф Я ТРОМБОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТ ЬЮ И CIIOCOB ЕЕ ПОЛУЧЕНИЯ. (57) 1. Стабилизированная урокиназа общей формулы 0 тЛ ми-т где Т - остаток сополимера акриламида и акриловой.кислоты с молекулярным весом 10200 ñ, ед. и содержанием .акриловой кислоты.1-20%

Ин-Ур урокинаэа, обладающая тромболитической активностью.

2. Способ получения стабилизированной урокиназы по п. 1, о т л и ч,а ю ц и и с я тем, что урокинаэу при температуре 0-25 С и рН

8,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акрилоSoN кислоты с молекулярным весом

10-200 тыс..ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20В, предварительно обработанным карбодиимидоМ.

1022988

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности, а именно к синтезу биологически активных химических соединений, проявляющих тромболитическую активность, в частности стабилизированной урокиназе .и способу ее получения. Описываемое соединение представляет собой продукт связывания урокиназы с синтетическим сополиФером акриламида и акриловой кис- 10 лоты.

Урокиназу используют в медици1 не как активатор плаэминогена, поскольку она облададт хорошо выраженными тромболитическими свойствами. Урокиназу применяют при лечении таких заболеваний как легочная тромбоэмболия, тромбозы глубоких вен, заболевания сосудов головного мозга, инфаркт миокарда.. О(днако терапия нативной урокиназой осложняется в связи с ее инактивацией под действием ингибиторов кров. ки и эндогенных протеаз, а также иэ-эа невозможности создания высокого локального содержания препа25 рата в пораженном органе. При лечении урокиназой необходимо неоднократно вводить высокие дозы препарата. Преодолеть указанные выше трудности позволяет связывание ферментов с высокомолекулярными носителями.

Известно производное урокинъзы, которое получают следующим путем.; урокиназу "вшивают" в полиакрил- 35 амидный гель после обработки его

1нитритом натрия в кислой среде.

Диазотированный таким способом носитель взаимодействует азосочетанием с ферментом. 40

При этом образуется водонерастворимое производное урокиназы, которое не может быть использовано в медицине 1).

Известен сгособ получения фер- 45 ментного препарата на основе пуллуланазы (КФ 3.?.1 ° 40) путем ковалентного связывания фермента с био-гелем КИ-100 (сополимер акриламида и акриловой кислоты) с помощью карбодиимида. Для получения иммобилизованного ферментного препарата частицы носителя (размер 100200 меш) обрабатывают 30 мин и . :кислой среде (рН 4) раствором фермента для.протекания адсорбции фер.— мента на носитель, после чего в реакционную смесь добавляется карбодиилид. Полученный продукт фильтруют и промывают дистиллированной водой и буферными растворами (2). 60

Однако данный способ не дает возможности пОлучить стабилизированную урокиназу, которую можно было бы испольэовать для медицинских целей, поскольку для лечебных ферментных препаратов наиболее благоприятной формой практического использования является растворимая., Таким образом, использование в качестве носителя водорастворимого сополимера акриламида и акриловой кислоты (мол.вес.

t.0-200 тыс. ед.) с содержанием последней 1-20%, а также изменение условий процесса приводят к получению нового соединения, обладающего ценными свойствами.

Цель изобретения - получение нового препарата - стабилизированной урокиназы, обладающей пролонгированной тромболитической активностью, повышенной термостабильностью, т.е. расширение ассортимента иммобилиэованных и стабилизированных ферментов медицинского назначения.

Поставленная .цель достигается свойствами стабилизированной урокиназы обшей формулы

О

T-5- @Tp где Т вЂ” остаток сополимера акрилами- да и акриловой кислоты с молекулярным весом 10200 тыс. ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%;

NH-Y — урокиназа, обладающая тромболитической активностью.

Способ получения стабилизированной урокиназы заключается в том, что урокиназу при температуре 0-25 С и рН 8,0-8,3 подвергают взаимодействию с сополимером акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 10-200 тыс.ед. и содержанием акриловой кислоты 1-20%, предварительно обработанным карбодиимидом.

Присоединение урокиназы к синтетическому высокомолекулярному носителю проходит через стадию актива" ции. карбоксильныХ групп сополимера карбодиимидом

О

6 НЮК, т-C + Rm-СМ -Т-С-о — e

1 2

GH

2 где T †. указанный выше сополимер, а затем активированные карбоксильные группы носителя реагируют с аминогруппами урокиназы

О

Ф ggR< 0 г + Н „

Ъ

1 Н Н

-" T-С вЂ” МН-У +К- e — -ц

R1М R2

Способ осушествляется следующим образом.

1022988 сополимером урокинаэы взяты для тромболизиса в соотношении, обеспечивающем их одинаковую эотеразную актив 5,ность по низкомолекулярному субстра3

Высокомолекулярный носитель - сополимер акриламида и акриловой .кислоты при слабошелочных значениях рН растворяют в растворе Фосфатное

ro буфера, затем на холоду — 5-10 С вносят в раствор определенное количество карбодиимида и через 20 мин добавляют раствор урокиназы. Реакцию связывания ведут 16 ч, после чего полученное производное урокиназы отделяют от других веществ с .помощью гель-хроматографического метода..

Полученный продукт представляет собой урокиназу, химически связанную с синтетическим полимерным носителем. Продукт полностью сохраняет биологическую активность по высоко-. молекулярным субстратам (напрнмер, плазминоген), не теряет каталитической активности при хранении в холодильнике (4-5 С) в растворимом виде в течение трех месяцев (в отличке от растворов нативного фер мента}, обладает повышенной термостабильностью и пролонгированной тромболитической активностью.

Синтез водорастворимого полимерного носителя осуществляют известным способом — радикальной сополнмеркзацией моиомеров в присутствии персульфата аммония в водном растворе 13 1. Сополимериэацию ведут при 60 С 4 ч.-.Общая концентрация,мономеров в реакцйонной смеси сос- . тавляет 5 вес.Ъ. Сополимер осаждают метанолом и высушивают ацетоном. Содержание акриловой кислоты в со- полимере составляет 3 вес.Ф, что является оптимальным для процесса получения ферментных произвопных.

Следует отметить, что увеличение содержания акриловой кислоты в со-. полкмере выше 20% не ведет к увеличению количества связанного бел-. ка, а низкое содержание акриловой кислоты в сополимере делает его биоинертным.

Пример 1. В 4 мг 0,001 И

Фосфаткого буфера (рН = 8,3) растворяют 20 мг сополимера акриламида и акриловой кислоты с молекулярным весом 100000 ед. и содержанием акриловой кислоты,ЗЪ. Затем на холоду (4 С) вносят в этот раствор

2,5 мг 1-этил-3-(3-диметиламкнопропкл)-карбодиимида и через- 20 мин после этого приливают 1 мг раствора нативной урокиназы в дистиллированной воде (250000.ИЕ/мл}. Реакцию связывания ведут 16 ч, а затем отделяют полученный препарат урокиназы, связанной с высокомолекулярным носителем, с помощью гель-хроматографии на колонне с сефадексом G- 150. По кинетическим параметрам гидролиза низкомолекулярных субстратов, по термостабкльностк по лученный препарат не уступает нативному Ферменту. С носителем связывается до 80% нсходното количества урокинаэы, сохраняемая зстеразная и амидолитическая активность

78-81%. Препарат не теряет каталитической активности по высокомолекулярные субстратам (плаэминоген), в системе in vitro с той же скоростью лизирует модельный тромб, как и препарат нативной урокинаэы. В фиd

10 зиологических условиях при 37 С производное урокиназы с сополимером практически не теряет своей каталитической активности 2 сут. Нативный фермент в этих условиях теряет бо15 лее 50% своей каталитической активности

Пример 2. Процесс проводится аналогично примеру 1, за искюпсчением того, что реакция связыва20 ния урокинаэы с полимерным носителем молекулярного .веса 10000 ед. и содержанием акриловой кислоты 1В осуществляется в 0,1 И растворе фосфатного буфера прк 25 С. В этом случае количество связанного с носителем фермента составляет 538, а сохраняемая препаратом эстеразная и амидолитическая активность 50-51%.

Пример 3. Процесс проводится аналогично примеру 1, эа исклю

® .чением того, что реакцию присоединения урокиназы.к сополимеру молекулярного веса. 200000 ед. и содержа нием акркловой кислоты 20% ведут в 1,0 Х растворе Фосфатного буфера при 0 С. С носителем связывается в этом случае 20% урокиназы от исходного общего количества фермента.

Сохраняемая препаратом эстеразная и амндолитическая активность 17%.

40 Таким образом, производные уро-киназы, полученные в примерах 1-3,. содержат различное количество фермента, связанного с носителем, что объясняется важной ролью величины

45 ионной силы раствора, зависящей от концентрации фосфатного буфера, при. проведении реакции связывания. Все производные обладают тромболитической активностью, сравниваемой с таковой для иативиой урокиназы. Кроме того, как видно из примера 1, полученные соединения обладают повышенной термостабильностью и. длительный срок сохраняют свою каталити55 ческую активность.

Тромболктические свойства стаби.лизированной урокиназы оцениваются по скорости лизиса тромба в среде буфера рН 7,4 в присутствии чело60 веческого плаэминогена (1 мг/мл) .

Препараты натнвной и связанной с

1022988

Скорость лиэиса тромба

Вид тромболитика

Ь во" а4

2а

100

Нативная урокиназа

0, 4 9

Продукт по примерам

125

0,61

110

0,54

104

0,51

Составитель О. Скородумова

Редактор Л. Авраменко Техред А.Ач КорректорС. Шекмар

Заказ 4155/16 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ту (метиловый эфир ацетилглициллизина) .

Результаты проведенных экспериментов представлены в таблице, где

С а представляет, собой отношение прироста оптической плотности раст.вора (в результате деструкции при тромболиэисе нерастворимого фибринового сгустка и переходе его фрагментов в раствор) к величине промея утка времени, эа который оно происходит и является параметром, характеризующим скорость тромболизи1 са.

Таким образом, из результатой, приведенных в таблице, видно, что препараты урокинаэы„ связанной с сополимером, даже превосходят по эффективности тромболитического дей ствия нативный фермент. Повышенная термостабильность полученных производных урокиназы. позволяет ферменту сохранять свою каталитическую активность более длительный период времени, чем нативному препарату, а это ведет, в свою очередь, к пролонгации тромболитического действия полученных производных урокиназы.

Синтез таких производных позволя. ет получать биологически активные препараты пролонгированного действия, пригодные для терапевтического использования. Варьирование количества фермента, связанного с носителем, в зависимости от значения величины ионной силы раствора, в котором протекает реакция связывания, удобно дпя индивидуального дозирования препарата. Применение таких производных урокиназы в медицине открывает новые возможности для эффективной борьбы с тромбоэами, ведет к снижению расхода дорогостоящего ферментного препарата, облегчает его применение.