Способ получения холестериноксидазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ , предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма , в том числе и рода Streptomycetaceae , на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, N«Heральные соли , MgSO 71120, FeSO47HjO и воду, с последуюьим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток, о т л и чающийся тем, что, с целью удешевления процесса, в качестве продуцирующего лдакроорганизма из рода StrepfcOTnycetaceae используют Streptcmq ces griseofuscus DSM 40191 или StreptOTayces higroscopicus DSM 40771 иЯи Streptoroyces acidonyceti cus ШМ 40798 и/или Arthrobacter paraffineus DSM 312. 2. Способ no П. 1, о т л и ч а ющ и и с я тем, что культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворилслй крахмал, пептон и минеральные соли СаСО, ШОз,НаС1 при следуюЕдем соотношении компонентов, вес.%; Растворимый i CO крахмал10-30 Пептон.2-10 Дрожжевой экстракт 2-10 ,5-3 КлНРО 0,2-2 t SO47HAO0,5-3 Had0,2-2 FeS047H,iO0,01-0,05 BonaОстальное ro o: да СЛ OS

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

РЕСПУБЛИН

„SU„„1026656

Э(59 N 9 08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -

К ПАТЕНТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2930501/28-13 (22) 04 ..06. 80 (31) Р 2924875 ° 7 (32) 20.06. 79 (33) ФРГ (46) 30.06.83. Бюл. 9 24 (72) Хельмгард Гауль, Георг Юаволь, Ханс Зайдель и Клаус Бокамп (ФРГ} (7 ) Берингер Маннхайм ГмбХ (ФРГ) (53) 577.15(088.8) (56) 1. Патент С0Ж 9 4093517, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1978 (прототип). (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ХОЛЕСТЕРИНОКСИДАЗЫ, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода Streptomycetaceae, на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, мйнеральные соли К1НРО», Мд804 ° 7Н20, PeSO4 ° 7Н О и воду, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью удеюевления процесса, в качестве продуцируютего микроорганизма из рода Streptomycetaceae используют

Streptomyces gr1seofuscus DSN 40191 или Streptcanyces higroscopicus DSN

40771 или Streptomyces acidomyceticus DSN .40798 и/или Arthrobacter

paraff1neus DSN 312.

2. Способ по н. 1, о т л и ч а юшийся тем, что культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворимый крахмал., цептон и минеральные соли

CaCO®, КАНОЭ,NаС1 при следующем соотношении компонентов, вес.В:

Растворимый крахмал 10- 30

Пелтон 2-10

Дрожжевой экстракт 2-10

СаСО 1-3 кмо, 0,5-3

К2 РО» О, 2-2

МдБО4 7Н О 0,5-3

МаСХ 0,2-2

РеЗО» 70 О 0 01 0 05 в Остальное

1026656

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается способа получения холестериноксидазы иэ микроорганизмов.

Известны различные виды микроорганизмов - продуцентов холестерин--оксидазы и способы получения этого фермента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ полу- 10 чения холестериноксидаэы, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода Streptomycetaceae, на питательной среде, содержащей дрожжевой 15 экстракт, минеральные соли К НРО, Mg804 ° 7820, РеЯО4 7Н20 и воду, с последующим выделением фермента иэ культуральной жидкости и/или из еТоК Х. 2О

Недостаток такого способа состоит в необходимости добавления индукторов для повышения активности фермента, которая невелика и достигает небольшой величины порядка 25

100 < /л.

Пель изобретения — удешевление процесса.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения холестериноксидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего микроорганизма, в том числе и рода Streptomycetaceae, на питательной среде, содержащей дрожжевой экстракт, минеральные соли

7Н20, Ре$04 ° 7820 и воду, с последующим выделением фермента из культуральной жидкости и/или из клеток, в качестве продуцирующего микроорганизма из рода 40

Streptomycetaceae используют $1кер оmyces griseofuscus DSM 40191 или

Streptomyces higroscopicus DSN 40771 или Streptomyces acidomyceticus

0ЯМ 40798 и/или Arthrobacter paraffi-45

Acus DSM 312.

Кроме того, культивирование ведут на среде, в состав которой дополнительно вводят растворимый крахмал, пептон и минеральные соли

СаСО, KN0,NaC1 при следующем соотйошении компонентов, sec,Ъг

Streptomyces nigroscopicus

BMTU 2093, 0ЯМ 40771,ATCC 10976

Общая характеристика: грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий.

Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев и крахмальном arape с минеральными солями могут быть серии красных и серых тонов (корице-коричнево-се. рый). На задней стороне колоний не

55 бо

Растворимый крахмал 10-30

Пептон 2-10

Дрожжевой экстракт 2-10

СОСО> 1-3 кыоэ 0, 5-3

К 2НР04 О, 2-2

MgS04 ° 7Н О 0,5-3

NaC1 0,2-2

FeS04. 7Н20 0,01-0,05

Вода 0сТ альн Ое

Сущность изобретения состоит в использовании штаммов продуцентов холестериноксидазы, способных продуцировать фермент беэ индуктора на сбалансированной по ростовым факторам питательной среде подобранного состава.

Ниже представлены характеристики используемых согласно изобретению штаммов микроорганизмов.

Streptomyces griseofuscus

BMTU 1616, DSM 40191, ATCC 23916

Общая характеристика: грамположительный азробный организм, который образует воздушный мицелий.

Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре иэ овсяных хлопьев, на крахмальном агаре с минеральными солями и на глицерин-аспарагиновом агаре могут быть серии красных или серых тонов (корице-коричнево-серый)

На задней стороне колоний не видно никаких специфических пигментов.

Растворимые пигменты: никакого образования меланоидных пигментов в пептон-дрожжевом агаре с железом, тироэиновом агаре или триптон-дрожжевом питательном растворе, а также образования пигментов в дрожжевосолодовом агаре, агаре из овсяных хлопьев, крахмальном агаре с минеральными солями или глицерин-аспарагиновом агаре нет.

Морфология цепи спор: спиральные участки. Зрелые, узкоспиральные цепи спор содержат 10-50 спор, поверхность спор гладкая.

Использование С-источников °

Использование D-глюкозы, L-арабинозы, D-ксилозы, Р-маннита и 0-фруктозы. Никакого роста или скудный рост на сахарове, инозите, рамнозе, рафинозе и лактозе.

Образцы алифатических жирных кислот: для представителей семейства Streptomycetaceae характерно преимущественное наличие изо/антеизо-С-15 и изо/антеизо-С-17.

Стенка клетки содержит типичную для Streptomyces LL-диаминопимелиновую кислоту. ?Н -Диаминопимелиновая или окси-DL-диаминопимелиновая кислота отсутстяу т.

1026656

55. Использование D-глюкозы., L-арабинозы, 0-фруктозы и сахарозы. Нивидно никаких специфических пигментов.

Растворимые пигменты г никакого образования меланоидных пигментов в пептон-дрожжевом агаре, а также образования йигмента в дрожжево-солодовом агаре, крахмальном arape c минеральными солями и агаре из овсяных хловьев нет.

Морфология цепей спор: спиральные участки. Пепи спор в узких, х эамк- 10 нутых спиралях, часто на ножках, состоят иэ 10-50 спор, поверхность спор гладкая.

Использование С-источников.

Использование D-глюкозы, D-ксило- 15 эы, D-фруктозы и D-маннита. Никакого роста или очень скудный рост на

L-арабинозе, рамноэе, сахарозе, рафинозе, инозите и лактозе.

Образцы алифатических кислот:

20 для представителей семейства Streptomycetaceae характерно преимущественное наличие иэо/антеизо-С-15 и изо/антеизо-С-17-алифатических кислот.

Стенка клетки содержит типичную для Streptomyces LL-диаминопимелиновую кислоту. DL-Диаминопимелиновая или окси-DL-диаминопимелиновая кислота отсутствует.

Streptomyces acidomycet1 30

BNTU 1873, DSN 40798, ATCC 11611

Общая характеристиками грамположительный, аэробный организм, который образует воздушный мицелий. 35

Окраска: колонии воздушного мицелия при росте на дрожжево-солодовом агаре, агаре иэ овсяных хлопьев и крахмальном агаре с минеральными солями могут быть серии красных (се- 40 рых) тонов (розовый, корице-коричневый). На задней стороне колоний при росте на дрожжево-солодовом агаре заметен пигмент желто-коричневого цвета, на агаре из овсяных хлопьев - красно-коричневого цвета и йа крахмальном агаре с минеральными солями — черного цвета.

Растворимые пигменты: образование меланоидных пигментов в пептондрожжевом агаре с железом. Другие пигменты типа упомянутых не образуются.

Морфология цепей спор: участки

Retinaculiaperti со многими прямогибкими цепями спор при росте на дрожжево-солодовом arape. На агаре из овсяных хлопьев и крахмальном агаре с минеральными солями - образование крючков, петель и коротких нерегулярных спиралей. Поверхность 60 спор гладкая. Использование С-источников. какого роста на рамнозе, лактоэе, рафинозе, D-манните и иноэите.

Для представителей семейства

Streptomycetaceae характерны изо/антеиэо-С-15 и изо/антеиэо-С-17-образцы алифатических кислот.

Стенка клетки содержит типичную для Streptomyces LL-диаминопимелиновую KHcJIOTó. ЭЬ-Диаминопимелиновая кислота или окси-DL-диаминопимелиновая кислота отсутствуют.

Arthrobacter paraffineus

BNTU 501, DSM 312.

Морфологияг от коротких до средней длины, коринеобразные столбики с типичным "снаппинг" -делением.

Нет никакого явно выраженного цикла развития, клетки на всех фазах развития столбикообразные. Клетки грамположительны и неподвижны. Никакого образования спор. Колонии íà HD-агаре бело-кремовой окраски и блестящие; нет никакого образования пигментов;

Физиологические свойства.

Отношение к кислороду — ярко выраженное аэробноеу образования кислот из глюкозы и лактозы не происходит каталиэата образуется; оксидаэа не определяетсяу восстановление нитрата — положительное; расщепление крахмала, желатины и каэеинаотрицательное; расщепление трибутурина - слабо положительное; уреаза образуется образование индола и

H> S — отрицательное; использование цйтрата — положительное; солевая толерантность — расчет в случае

5% NaCl, никакого роста при 10% NaC1.

Пептйдогликан стенки клетки содержит меэо-диамино-пимелиновую кислоту.

Пример 1. Streptomyces

griseofuscus DSN 40191 (равноценен

ATCC 23916 и iFO 12870) культивируют в среде следующего состава, r/лРастворимый крахмал 20

Дрожжевой экстракт (Дифко)

Пелтон {мясной)

Карбонат кальция 3

Нитрат калия 1

Дикалий-Аосфат К2НРО4 О, 5

NgSO4.7Н О 1,03

Хлористый натрий 0,5

FeSO4 7HgO 0,02

Итамм культивируют 2 дня в 10 мл среди в колбе Эрленмейера на 100 мл, затем переносят в 40 мл такой же среди в колбе Эрленмейера (3 дня), отбирают пробу и проверяют активность холестерином дозы в отделенном культуральном растворе и в экстракте-сырце. Экстракт-.сырец получают центрифугированием 5 мл культу

1026656

Общее, - u/ë

Эксттрактсятэец, v/ë

Культуральный раствор .после отделения„

U/л

Ллительность культивирования, дни

Пример

4765 1260 3506

5223 1423 3800

1656

721

935

711

2052

Составитель И. Привалова

Редактор Н. Безродная Техред О. Неце Корректор B. Бутяга

Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного кочнтета СССР.по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Зак аз 4591/51

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

I рального раствора, промыванием биомассы 0,05 М фосфатным буфером рН 7, торным суспендированием в

5 мл такого же буфера и распределением посредством добавки 0,2 мл

10%-ного раствора продукта "Тритон-К-100". После 10 мин выдержки при комнатной температуре центрифугируют и получают отделившийся культуральный раствор в виде экстрактасырца.

Для проведения определения активности измеряют образование холестенона посредством прироста погасания (экстринкции) при 240 мм, при рН 7,5 в 0,5 моль/л фосфатном буфере. Для контроля каждый раз определяют холостую величину без добавления холестена.

Были получены следующие значения v /лг

Общее — культурального раствора 5741

Эк стр ак та- сырца, полученного из этого раствора 1118

Отделенного культурального раствора 4623

Пример 2. Повторяют способ по примеру 1 с применением Streptomyqes higroscopicus DSM 4077 (соответствует ATCC 10976).

Определения проводят через 3 и

4 дня в течение культивирования.

Значения активности приведены в таблице.

В случае культивирования в присутствии 2Ъ холестерина в качестве индуктора прирост активности составляет величину меньше половины.

Пример 3. Повторяют способ по примеру 1 с применением Strepto

myces acidomyceticus DSN 40789 ((соответствует ATCC 11611 и iFO 3125).

Результаты при длительности культивирования 3 и 4 дня показаны в таблице.

10 При проведении культивирования при наличии 2% холестерина в качест= ве индуктора прирост активности увеличивается на 50%.

Пример 4..Повторяют способ

15 по примеру 1 с применением Arthrobactert paraffineus DS 312 (соответствует ATCC 15591), одйако при условии добавления к среде ЭЪ холестерина в виде суспензии в дрожжевом экстракте (суммарное количество

10 г/л). После четырехдневного культивирования в экстракте-сырце обнаружено значение м/л= 4470. В культуральном растворе после отделения также установлена значительная активность.

Применение: изобретения позволяет" существенно удешевить способ произ водства .за счет достижения более высоких значений активности холестериноксидазы. При этом особое преиму-щество заключается в возможности исключения индуктора холестериноксидазы, что приводит не только к дополнительному удешевлению способа, З5 но также к значительному повышению воспроизводимости способа.