Реагент для определения аденозин-5-трифосфата

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

{191 (11) з(я) С 12 1/ 6

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -, .;:.;::.,-. i :

H АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 340 0251/28-13 (22) 22. g2.82 (46) 15.09.83, Бюл. 34 (72) Н.Н.Угарова, Л.Ю.Бровко, E.È,Áå. ляева и И.B.Áåðåçèí (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена

Трудового Красного Знамени государ" ственный университет им. И.S.Jlo» моносова (53) 577. 15(088,8) (56) l. Bergmeyer H. Methods of

Enzymatic Analysis, N.J. Acad. Press, 1974.

2. Lundin А., Styrelius l., С11п, Chem., Acta, l978, v. 87, 199"209.

3. Авторское свидетельство СССР по заявке М 3298668/28-13, кл. С 12 и 9/02, 1981. (54) (57) 1, РЕАГЕНТ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

АДЕНОЗИН-5 "ТРИФОСФАТА, включающий люциферазу, выделенную из светляков, люциферин, соль магния, буфер, стабилизатор и воду, о т л и ч à ешийся тем, что, с целью повышения стабильности, он содержит лю- циферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, в качестве буфера - смесь трис-(оксиметил)-ами.нометана и уксусной кислоты, в ка" честве стабилизатора -.смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом, в качестве соли магния " сульфат магния, при следующем соотношении компонентов, мас.ь:

Иммобилизованная на полисахаридном носителе люцифераза 0,067-0,670

Люциферин 0,002-0,015

Сульфат магния 0,48-0,72

Уксусная кислота 0,02-0,04 трис-(Оксиметил)-аминометан 0,08-0,16

Этилендиаминтетра- ацетат натрия 0,03-0.,06

Дитиотреитол 0,05-0,1

Вода Остальное

2, Реагент по и. 1, о т л и " ч а ю шийся тем, что îí concept жит люциферазу, иммобилизованную на полисахаридном носителе, активированном бромцианом, с удельной ак тивностью (3 104-1 10 ) Е/мг.

0,33

0,68

0,13

- 3 10415

Изобретение относится к биохимии и касается состава для количественного определения аденозин-5 -трифосфата (АТФ) на основе иммобилизованной люциферазы светляков. 5

АТФ является одним из наиболее важных метаболитов,.количественное определение которого необходимо для целей медицинской диагностики и для анализа загрязнений окружающей щ среды.

Известен реагент основе двухкомпонентной ферментной- системы, включа" ющей фосфоглицвраткиназу и глицеральдегидфосфатазу. Определение АТФ ве- 15 дется спектрофотометрически по ско" рости накопления никотинамидадениндинуклеотида (НАД), Чувствительность анализа не превышает 1-50 мкИ f1(.

Наиболее близким к предлагаемому 20 является реагент на основе раствори" мой люциферазы, выделенной из светляков, содержащий люциферин, ацетат магния, буфер - смесь имидазола и уксусной кислоты, стабилизатор - смесь 25 этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТР) и ацетилцистеина, бычий сывороточный альбумин., воду при следующем соотношении компонентов, мас.3:

Люцифераза светляков 0,002 3р

Люциферин 0,013

Ацетат магния 0,47

Бычий сывороточный альбумин

Имидазол

Уксусная кислота

Этилендиаминтетраацетат натрия . 0,03

Ацетилцистеин g,24

Вода остальное (2J ..

Анализ основан на регистрации интенсивности биолюминесценции, возникающей при ферментативном окислении кислородом воздуха люциферина в 4 присутствии АТФ и солей магния. Ин45 тенсивяость свечения пропорциональна концентрации АТФ в анализируемом образце. Достоинством метода является возможность определения АТФ в присутствии других метаболитов (специфичность), а также высокая чувствительность анализа (10 И), зна-6 чительно превышающая чувствительность, достигаемую другими методами, Приведенная композиция позволяет получить свечение, которое, -достигнув максимума, остается постоянным в течение нескольких минут. Устой68 з чивость свечения во времени обесяе" чивает высокую точность определения и создает предпосылки для автоматизации анализа.

Недостатком состава является его невысокая стабильность. В лйофи-" ,лизованном состоянии при 4@C реагент в течение недели полностью теряет свою ферментативную активность. Поэтому для достижения предельной чувствительности определения необходимо использовать свежеприготовленный раствор реагента и перед каждым измерением заново строить калибровочный график: концентрация АТФ- ин тенсивность свечения.. Это приводит

;не только к усложнению метода, но .и значительным потерям дефицитного . фермента.

Цель изобретения - повышение стабильности реагента для определения

АТФ.

Поставленная. цель достигается тем, что реагент для определения аденозин-5 -трифосфата, включающий люциферазу, выделенную из светляков, люциферин, соль магния, буфер, стабилизатор и воду содержит люциферазу светляков, иммобилизованную на полисахаридном носителе в качестве буфера - смесь трис"(оксиметил)-амино". метана и уксусной кислоты, в качестве стабилизатора - смесь этилендиаминтетраацетата натрия с дитиотреитолом, в. качестве соли магниясульфат магния, при следующем сост" ношении компонентов, мас.Ф

Иммобилизованная на полисахаридном носителе люцифераза 0 067"0,670

Люциферин 0,002-0,015

Сульфат магния :.g,48-0,72

Уксусная кислота 0,02-0,04 трис-(Оксиметил),-аминометан 0,08-0,16

Этилендиаминтетраацетат натрия 0,03-0,06

Дитиотреитол 0,05-0,1

Вода Остальное

В отличие от состава, принятого за прототип, предлагаемый реагент содержит люциферазу светляков, иммобилизованную ковалентно на нерастворимом полисахаридном носителе. Удельная активность препарата иммобилизованной люциферазы должна быть в пределах 3 10 -1-.10 Е за 1 мг препарата иммобилизованного ферменна (Е - международная единица актив-.

1041

0,13

0,006

0,60

Предел обнаружения АТФ с исполь" зованием предлагаемого реагента

10 И. 55

Il р и м е р 1. Приготовление реагента для определения АТФ на основе. люциферазы, иммобилизованной на

3 ности, 1 Е - количество фермента, которое катализирует превращение

1 мкмоль субстрата в 1 мин). При активности меньше 3 ° 10 E/ìã уменьшается чувствительность анализа. Препарат с активностью более 10 Е/мг

:з использовать .нецелесообразно из-за непроизводительного расхода фермента при приготовлении иммобилизованного препарата. Кроме того, исполь- 10 зование фермента с активностью вы" . ше 10 Е на 1 мг иммобилизованного фермента не приводит к повышению чувствительности определения.

В качестве буфера вместо имидазолацетата предлагаемый состав включает трис-(оксиметил)-аминоме» тан - ацетатный буфер, а вместо .стабилизирующей смеси этилендиаминтетраацетата (ЭДТА ) и ацетилцистеина смесь ЭДТА с дитиотреитолом. Допол. нительное стабилизирующее влияние оказывает и вводимый в смесь сульфат магния за счет повышения ионной силы. 25

Реагент получают добавлением к концентрированной суспензии иммобилизованной люциферазы в трис-(оксиметил)-аминометан-ацетатном буфере раст-. воров люциферина, сульфата магния, ЭДТА, дитиотреитола в том же буфере.

Реагент обладает повышенной стабильностью. Период его полуинакти- вации .при 4 С 40-50 дней. В лиофилиО зованном состоянии реагент хранится

35 при 4вС без значительной потери ферментативной активности в течение года. Стабильность полученного состава в несколько раз превышает стабиль4О ность индивидуального препарата иммобилизованной люциферазы.

Наблюдаемый эффект является следствием совместного присутствия в составе реагента иммобилизованно- .

45 го фермента, смеси ЭДТА с дитиотреито лом, трис-(оксиметил) -аминометан-ацетатного буфера и сульфата магния.

При этом смесь ЭДТА с дитиотреитолом не оказывает заметного стабилизирующего влияния на растворимый фермент,.

568 ф сефарозе, ультрадексе, ультрагеле, активированных бромцианом. а. К 2 мл суспензии люциферазы, иммобилизованной ковалентно на ультрагеле по известному методу $3) с концентрацией 10 мг/мл и активностью

3 10 Е на 1 мг препарата иммобилизо4 ванного фермента:s 0,01 И трис-(оксиметил)-аминометан-ацетатном буфере, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,5 мг/мл дитиотреитола, добавляют 4 мл раствора люциферина с- концентрацией

0 54 мМ и 24 мл 50 мМ раствора сульфата магния в том же буфере. Получают реагент при следующем соотно- . шении компонентов, мас.4:

Иммобилизованная люцифераза светля-. ков 0,067

Люциферин 0,002

Сульфат магния 0,48 трис-(Оксиметил)-аминометан Этиленди аминтетраацетат натрия 0,03

Уксусная кислота 0,02

Дитиотреитол 0,05

Вода Остальное б. К 4 мл суспензии люциферазы, иммобилизованной ковалентно на уль" традексе, с концентрацией 1Омг/мл и активностью 6 10 Е на 1 мг иммобилизованного фермента в 0,015 И трис-(оксиметил)-аминометан-ацетатном буфере, содержащем 1,5 мИ ЭДТА и

0,7 мг/мл дитиотреитола, добавляют

4 мл раствора люциферина с концентрацией 1,6 мИ и 22 мл 67 мИ раство. ра сульфата магния в том же буфере. Получают реагент, имеющий следующий состав, мас.3:

Иммобилизованная люцифераза светляков

Люциферин

Сульфат магния трис-(Оксиметил)-аминометан,0,12

Этилендиаминтетраацетат натрия 0;045

Уксусная кислота - 0,03

Дитиотреитол 0,07

Вода . Остальное в. К 20 мл суспензии люциферазы, иммобилизованной ковалентно на сефарозе, с концентрацией 10 мг/мл и активностью 10 Е на 1 мг иммобилизованного фермента, в 0,02 М трис

-(оксиметил)-аминометан-ацетатном буфере, содержащем 2 мИ ЭДТА и

1041568 б

50,Пример 3. Испытание стабильности реагента.

В таблице указаны значения пери; ода полуинактивации реагента, в том числе в лиофилизованном состоянии.

Для сравнения приводится аналогичный показатель для известного реагента на основе растворимой люцифера»

1 мг/мл дитиотреитола, добавляют

4 мл раствора люциферина с концентрацией 3,9 мМ и 6 мл 0,3 М раствора сульфата магния в том же буфере.

Получают реагент, имеющий следующий состав, мас.3:

Иммобилиэованная люцифераза светляков 0,67

Люциферин 0,015

Сульфат магния 0,72 трис-(4ксиметил)-аминометан 0,16

Этилендиаминтетраацетат натрия 0,06

Уксусная кислота О., 04 !

Дитиотреитол ОФ1

Вода Остальное

П р и м е .р 2. Приготовление. ре- - агента для определения АТФ на основе люциферазы, иммобилизованной на целлофановой пленке.

K 1,0 мл 0,02 М трис-(.оксиметил)- аминометан-ацетатного буфера,, содержащего 2 мМ ЗДТА и 1 мгlмл дитиотреитола, добавляют 0,2 мл раствора

25 люциферина с концентрацией 1,5 мМ и 0,2 мл 0,4 М раствора сульфата магния в том же буфере ° В полученный раст- вор опускают целлюлозную пленку с иммобилиэованной на ней известным методом (31 люциферазой- массой 7 мг и площадью 25 мм с активностью

3-10"E на 1 мг иммобилизованного фермента;Получают следующйй состав реагента, мас.4: 35

Иммобилиэованная люцифераза светляков 0,5

Люциферин 0,006

Сульфат магния 0,69 трис- (Оксиметил) - 40

-аминометан 0,16

Этилендиаминтетраацетат натрия 0,06

Уксусная кислота 0,04

Дитиотреитал 0,1 45

Вода Остальное

Изменение площади взятой целлюлозной пленки позволяет варьировать содержание фермента в прелах, приведенных в формуле изобретения.

Реагент по способу

П Юлу пери од и на ктивации, дни в водной суспензии в лиофилизованном сос тоянии

Предлагаемому по примерам

1а

150

150.50

150

50 фирмы LKB (прототип) Иммобилизованной люциферазы

20

Пример 4.. Методика опреде-. ления АТФ.

1,4 мл реагента, полученного как описано в примере 1 или 2, вводят в цилиндрическую кювету объемом

3 мл и диаметром 1 см., которую затем помещают в кюветное отделение люминометра и регистрируют фоновый сигнал. Затем с помощью шприца быстро вводят 0,5 мл раствора АТФ с известной концентрацией, не прерывая. регистрации свечения. Разность между величиной сигнала интенсивности биолюминесценции в присутствии и в отсутствие АТФ является величиной, пропорциональной концентрации АТФ. Опыты повторяют для растворов АТФ с концентрациями АТФ зы светляков и индивидуального препарата люциферазы, иммобилизованной на сефароэе. Для оценки периодами полуинактивации определяется изменение уровня ферментативной активности образца по интенсивностй свечения, возникающего при добавлении в образец стандартного количества

АТФ (пример 4). Цифры, указанные в нижеследующей таблице, показывают, что стабильность предлагаемого реагента по крайней мере в 25 раз превышает стабильность состава - прототипа и в 2,5 раза превышает стабильность индивидуального препарата иммобилиэованной люциферазы.

Составитель О.Скородумова Редактор 8.Ковтун . .Техред И.Гайду .

Корректор С.Шекма р

«»«

Заказ 7065/26 Тираж 523 Подписное

8НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

I ° « «

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 в том we диапазоне, в котором предполагается проводить измерения. Прямая пропорциональность между интенсивностью биолюминесценции и концентрацией АТФ наблюдается в диапа" 5 зоне от 10 .И до 10 И АТФ. На основе полученных данных строят график за." висимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. При ра" боте с образцами с концентрацией ®

АТФ 10 6-10 И рекомендуется предпочтительно использовать реагент, описанный в примере 1а или 2, 8 концентрацией 10 -10 "И " реагент, описанный в примере 16, с концентрацией

АТФ 10"-10 М - реагент, описанный в примере 1в. Концентрацию АТФ в нв., известном образце определяют по,интенсивности свечения, возникающего при добавлении 0 5 мл неизвестного 2О

68 8 образца АТФ к 1,4,мл реагента, используя калибровочный график, полученный, как описано выше. Предел обнаружения концентрации АТФ указанным методом составляет 1.10"И.

Предлагаемый реагент для определения АТФ может быть использован в научных целях для изучения процессов, связанных с превращениями АТФ, а также в целях медицинской диагностики. С помощью этого препарата по уровню креатинфосфокиназы в крови можно проводить раннюю диагностику инфаркта миокарда и ряда других заболеваний, экспресс-анализ на чувствительность микроорганизмов к антибиотикам. Определение уровня АТФ в водоемах позволяет судить об их биологической продуктивности и уровне загрязненности.