Способ получения ферментов 1.4.1.3,1-глутамат: ад( @ )+ - оксиредуктазы и 1.4.1.4,1-глутамат: ад( @ )+ - оксиредуктазы(дезаминирующих)

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ 1 .i.1.3, 11ГЛУТАМЛТ:НАО(Р)+.ОКСИДОРЕ1ДУКТАЗЫ И 1.1. 1.1, 1-ГЛУТАМАТ;МАО Р -ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (ДЕЗАМИНИРУЮЩИХ) путем экстракции одноклеточных зеленых водорослей фосфатным буфером с последующим фракционированием экстракта , о т л и ч ею щ и и с я тем, что,с целью ускорения способа и увеличения выхода каждого фермента, в экстракт добавляют хлористый марганец до конечной концентрации 0,025-0,030 М,осадок фосфата марганца, сорбирующий 1..1.3 1-глутамат: NAD (Р) -оксидоредуктазу , отделяют от жидкой фазы, содерi жащей 1Л.1. t-глутамат: NAD .ксидоредуктазу , центрифугированием и 1.it.1.3, L-глутамат: NAD(P)-оксидоредуктазу элюируют с осадка 0,1 - О,2М фосфатным буфером . О 4 О) СО

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1044681

san) С 12 и 9/06

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ Ф р

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1-""- ...":;:::-""-"::- ",.3

И ABTOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ Ф Фда id ) „.„ 1 ром. (21) 3357968/28- 13 (гг) 19. 11.81 ° . (46) 30.09.83.Бюл. М 36 (72) А. В. Софьин, Л. П. Лосева и В. P ° Шатилов (71)i Ордена Ленина институт биохи мии им. А. Н. Баха (53) 577, 15 (088. 8) (56) 1. geung Н.Т,,Turner К,J., Bas-

combNF.,Schmidt R.R. Pur if ication of

an ammonium-1пдис ible gautama te dehudrogenase and the use of its antigen affinity column-purified antibody in spec if ic immunopreci pi tation . and immunoadsorption procedures.Ana1yt. Вiochem., ч, 110, 11 1, 1981,: р. 216-228.

2. Шатилов В,Р,, Амбарцумян В.Г., Кретович В. А. Препаративное разделение глутаматдегидрогеназ из одноклеточных водорослей.-Докл.АН СССР, 1972, 207, N 5, с. 1229-1232. (54) (57) СПОСОБ .ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТОВ

1.4.1.3, 1. ГЛУТАМАТ:NAD(Р)+ОКСИДОРЕ1 4.1.4, Р -ОКСИДОРЕДУКТАЗЦ (ДЕЗАМИНИРУЮЩИХ) путем экстракции одноклеточных зеленых водорослей фосфатным буфером с последующим фракционированием .экстракта, отличающийся тем, что,с целью ускорения способа и увеличения выхода каждого фермента, в экстракт добавляют хлористый марганец до конечной концентрации 0,025-0,030 М,осадок Фосфата марганца, сорбирующий 1.4.1,3, Lглутамат:NAD (P)+ оксидоредукта3у, отделяют от жидкой фазы, содержащей 1.4,1.4, 1-глутамат: NAD Р -ок- 9 сидоредуктазу, центрифугированием и 1.4.1.5, L-глутамат: NAD(P)-оксидоредуктазу элюируют с осад. С ка 0,1 - 0,2И фосфатным буфе1 10

Изобретение относится к физико-хич мической биологии и биотехнологии, в частности.к способам получения и очистки ферментов.Известен способ получения иэо:.ферментов. путем аффинной хроматографии 1 1 g.

Указанный способ является достаточно трудоемким и длительным, Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому эффекту является способ разделения ферментов 1.4.1.3,L-глутамат:

ИАО (Р) -оксидоредуктазы и 1.4.1.4, L-глутамат:NAD Р+"оксидоредуктазы на одноклеточных зеленых водорослях, включающий получение .экстракта из клеток водорослей(2, Разделение глутаматдегидрогеназ

flo известному способу предусматривает подготовку колонки с ДЭАЭ-целлюлозой, которая заключается в обработке ионообменника 0,5И НС1, а затем

0,5M NaOH с последующей отмывкой на воронке Бюхнера большим объемом дис- 25 тиллированной воды до нейтральной реакции; заполнение колонки заряженной ДЭАЗ -целлюлозой и уравновешива- . ние ее стартовым буфером; предвари44631

2 тельную очистку бесклеточного экстракта от мешающих ионообменной хроматографиии хлорофилл-липопротеидных комплексов, которая осуществляется осаждением белков сернокислым аммонием от 35 до 65 / от насыщения с пос 1едующим обессоливанием белкового препарата на колонке с Сефадексом

С-25;нанесение белкового препарата, 10 содержащего разделяемые ферменты, на готовую колонку с ДЭАЭ-целлюлозой; промывку колонки стартовым буфером с целью удаления несвязывающегося с ДЭАЭ-целлюлозой белка;

15 ступенчатую элюацию семью буферными растворами повышающейся ионной смолы, так как ЙА0 (Р)-глутаматдегидрогеназа (1.4.1.3,L-глутамат:NAD (Р)оксидоредуктаэа) смывается с колонки

20 0,08-0,1И фосфатным буфером, à NAD P- глутаматдегидрогеназа (1.4.1.4„L -глутамат:ЙА0 Р+-оксидоредуктаэа)-0,2И

ИаС! в 0,1И фосфатном буфере.

Т а б л и ц а 1

Общая активность мкмоль/мин

Удельная активност мкмоль/мин на 1 мг белка

Белок, мг

Степень очистки

Выход, о

Фракции

NAD (P)- NAD РГДГ ГДГ

NA0 (P)ГДГ

NAD РГДГ

Бескле точный акстракт

1710 363

О, 212

0,021

100

Высаливание сернокислым аммонием,фракция

35-654 от насыщения

623 160

0,028

0,257

1,25 50

14,3 24

0,413

12,6 0,0

0,0 фракция 0,1И йаС! в 0,1И фосфатном бу" фере

36 7 202 " 0 0 5 500

26

0,0

Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе: фракция 0,08И фосфорный буфер 30,4

Вся процедура занимает 58-60 ч.

Данные по разделению глутаматдегидрогеназ из Chlorella pyrenoidosa

82 Т с помощью ионообменной хроматографии представлены в табл. 1.

l мг

Таблица2

Удельная активность мкмоль/мин на 1 мг белка

Общая . активность,.

MKMollb/мин

Фракция.4

Степень Выход, очистки

НА0 (Р)ГДГ ГДГ

ЙА0 (Р) - NAO РГДГ ГДГ

Бесклеточный экстракт

0,13

3790 496

0,25

100

Нвдосадочная жидкость после обработки раствором хлори стого марганца и центрифугирования 2290

1,4 82

0,0

0,34

0,0

779

Элюат с осадка фосфата марганца 1010 470 I

0,0

0,47

3,6 95

0,0 з 1044631, . 4

К недостаткам способа относится зеленой водоросли Andri strodesmus brauто, что разделение NAD (Р) -глутамат- . и 1 (в случае другой водоросли темпедегидрогеназы и NAD P-глутаматдегид-, Ратура экстракта мОжет быть повырогеназы является длительным, трудо- . 1mesa до 15 С), содержащего йА0 (Р)о емким, требует обязательной предва- 5 глутаматдегидрогенаэу и NAD P-глурительной очистки и дает относитель- таматдегидрогенаэу, по каплям при но низкий выход ферментов. Кроме того, интенсивном перемешивании добавляют

ДЭАЭ-целлюлоза является дефицитным расТаор МпС12 (иэ расчета 2,5 мл импортным материалом. 1М раствора НпС12 на 100 мл экстракЦель изобретения - ускорение спо-. 10 та) ° В этих условиях в течение соба и увеличение выхода ферментов,. 20. мин происходит образование и

Поставленная цель достигается ф рмирование осадка фосфата маргантем, что согласно способу получения ца на котором адсорбируется МА0 (Р); ферментов 1.4.1.3, L-глутамат: NAD (Р) -. глутаматдегидрогеназа. Образовавоксидоредуктазы и 1.4,1.4,L-глута- 15 вийся осадок отделяется от надосамат:.NA0 Р оксидоредуктазы (дезами- дочной жидкости, содержащей NAD Рнирующих) путем экстракции однокле-: . глутаматдегидрогеназу, центрифугиточных зеленых водорослей фосфатным Рованием при 8000 g в течение 30 мин буфером с последующим фракционирова- и для Удаления захваченных осадком нием экстракта в экстракт добавляют 20 JlHlllHHx белков, промывается 100 мл

l хлористый марганец до конечной кон- . 0,0 1М фосфатного буфера рН 7,4.3люцентрации 0,025-0,030 М, осадок Фос- Чия NAD (Р)" глутаматдегидрогеназы фата марганца, сорбирующий 1 4.1,3,L- с осадка осуществляется 0,1М фосфатглутамат:NAD (P) -оксидоредуктазу,от- . ным буфером РН 7,4 двумя порциями деляют от жидкой фазы, содержащей д по 100 мл.Обьединенный элюат содер1.4.1.4,L-глутамат:NAD Р+ оксидоре- " жит практически всю NAD (P)-глутадуктазу, центрифугированием и 1.4.1..3,. матдегидрогеназу, а .е надосадочной

L-глутамат:NA0 (Р)+-оксидоредуктазу жидкости сохраняется более 803 элюировать с осадка 0,1-0,2 M фосфат- NAD P-глутаматдегидрогенаэы. Вся . ным буфером. пРоцедура занимает 2,5 ч.

П р и м е. р. К 400 мл охлажденно- .. Результаты разделения глутаматдего до 5-« С экстракта в 0,05М фосфат гидрогеназ предлагаемым способом предном буфере (РН 7,4) из одноклеточной .. ставлены в табл.2.

104463-1

Составитель С. Каспаров

Редактор В.Петраш Техред В.далекорей . Корректор C церни

Заказ 7462/21 Тираж 523 . Под ..=мое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, W-35, Раушская наб, д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул ° Проектная, Таким образом, предлагаемый способ разделения глутаматдегидрогенаэ по сравнению с известным не требуе предварительной очистки ферментов,т позволяет разделить их уже на стадии бесклеточного экстракта; значительно сокращает время, необходимое для разделения (с 58 до 2,5 ч, т.е. более чем в 20 раэ); кроме того,уве личивается выход разделяемых фермен тов (по известному способу выход после разделения 56 и 243 для NAD (Р)т глутаматдегидрогеназы и NAD P- глута.е. матдегидрогеназы соответственно, а

5 по предлагаемому способу 90 и 824); существенно снижается трудоемкость и удешевляется весь процес разделения за счет исключения колоночной ионообменной хроматографии,