Способ получения 5-или 3-фосфоамидов моно-или олигонуклеотидов
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 5- ИЛИ 3-ФОСФОАМИДОВ .МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕО-, ТИДОВ, путем конденсации нуклеотидной компоненты с аглинной в растворителе в присутствии производного кapбoдии шда , отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта в качестве нуклеотидной компоненты используют водорастворимые соли нуклеотидов , в качестве растворителя. воду , в качесЗтве производного карбодиимида - 1-этил-З-(З-лиметиламинопропил )карбода1имид, в качестве аминной компоненты - водный раствор ами|На с рН 4,5-10, при условии, что рН с раствора амина на It0,1 меньше рК (Л амина.
(l9) SU (11) СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
ОПИСЛНИК ИЗОБРЕтеНИЯ :
Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ (21) 3388063/23-04 (22) 28. 01. 82 (46) 23. 10. 83. Бюл. Р 39 (72) М. Г. Ивановская, M. В. Готтих и Ç.A.Øàáàðoâà (71) Московский ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет иМ.М.В.Ломоносова (53) 547.454.07(088 ° 8) (56) 1. Соколова Н.И., Носова В.В., хабарова З.А., Прокофьев М.А ° .Новый метод синтеза амидов олигонуклеотидов. Докл. AH СССР. 1972, 206 9 1 с. 129-131.
2. Соколова Н.И., Гатинская Л.Г., Недбай В.К., Смирнов В.Д., Рухляда Н.Н., Шабарова З.A. Прокофьев И.А.
Синтез амидов олигонуклеотидов.
Докл. AH СССР, 1971, 19Я,, 9 3, 613616 (прототип).
3(59, С 07 Н 19/06 е С 07 Н 19/16;
С 07 Н 21/00 // A 61 К 49/00 (54) (57) СПОСОВ ПОЛУЧЕНИЯ 5 - ИЛИ
3 -ФОСФОАМИДОВ МОНО- ИЛИ ОЛИГОНУКЛЕО, ТИДОВ путем конденсации нуклеотидной компоненты с аминной в растворителе в присутствии производного карбодиимида, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса и увеличения выхода целевого продукта, в качестве нуклеотидной компоненты используют водорастворимые соли нуклеотидов, в качестве растворителяводу, в качестве производного карбодиимида — 1-этил-3-(3-диметиламинопропил )карбодиимид, в качестве аминной компоненты — водный раствор ами)на с рН 4,5-10, при условии, что рН а раствора амина на 1+0,1 меньше рК Е амина.
1049498
Изобретение относится к способу получения фосфоамидов моно- или олигонуклеотидов, которые широко используются в биоорганической химии и молекулярной биологии в качестве исходных соединений для получения соответ- 5 ствующих ди- и трифосфатов, реагентов для аффинной модификации белков и нуклеиновых кислот, а также для химической "сборки" полинуклеотидов в матрично-направленных реакциях. 10
Кроме того, соединения этого класса, содержащие в своегл составе остаток аминокислоты или пептида, используются в молекулярно-биологических исследованиях в качестве моделей природных нуклеопротеидов.
Известен способ получения 5 — или
3 - Сначала получают смешанный ангидрид нуклеотида и мезитиленкарбоновой кислоты при действии хлорангидрида гкислоты в безводном пиридине, затем избыток реагента удаляют экстракцией эфиром и к остатку добавляют амин либо в водном, либо в безводном растворе. Если ам1лн добавляют безводным,, процесс заканчивается через несколько часов, а в водной среде — .через 2-3 сут. Для проведения первой стадии — получения смешанного ангидрида необходимо предварительно переводить моно-. или олигонуклеотид в соответствующую раствориглую в пиридине форму, например,три-н- алкилаглглониевую. Этот способ практически нельзя применять для получения амидов олигонуклеотидов риборяда, так как в результате ацилирования межнуклеотидных фос- 4Q фатных груггп в значительной мере происходит разрыв и изоглеризацИя межнуклеотидных связей. Крогле того,при работе со слабыми аминами рК 5 эффективность способа заметно понижает-4g ся. Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаеглому положительному эффекту является способ получения 5 -или 3 -фосфоамидов 5О моно- или олигонуклеотидов, заключающийся в конденсации нуклеотидной коглпоненты (пиридиниевой или три-н-алкиламмонийной соли глоно- или олигонуклеотида ) с безводным амином. в безводном органическогл растворителе (безводный пиридин или диметилформаглид ) в присутствии производного карбодиимида (дициклогексилкарбодиимида ). Процесс протекает в течение 2-3 сут при 37 . Выход целевого про- 60 дукта 50 — 80ъ L2 3. Недостатком известного способа получения является относительно низкий выход целевого продукта. При длительном выдерживании олигонуклеотидов в безводных растворителях в присутствии дициклогексилкарбодиимида происходит нежелательная глодификация межнуклеотидных фосфатных групп, причем степень модификации возрастает с увеличением длины олигонуклеотида. Недостатком способа является также необходимость проведения процесса в безводном растворителе, так как для крупных олигонуклеотидных блоков практически невозможно количественно перевести олигонуклеотид в растворимое в органическом растворителе сос тояние. Кроме того, указанный способ не дает возможности получать амиды, содержащие в своем составе остатки сильных аминов, значение рКд которых более 10, что связано, с одйой стороны, с плохой растворимостью олигонуклеотидов при добавлении таких аминов и с другой стороны, с низкой реакционной способностью дициклогексилкарбодиимида в присутствии сильных аминов. Целью изобретения является упрощение процесса и увеличение выхода целевого продукта. Цель достигается согласно способу получения 5 — или 3 -фосфоамидов Моно- или олигонуклеотидов, заключаю1щемуся в конденсации в водной среде водорастворимых солей нуклеотидов с водным раствором амина с рН 4,5-10 при условии, что рН раствора амина на 1 0,1 меньше рК амина, в присутствии конденсирующего агента — 1-этил-3-(3-диметиламинопропил )карбодиимида, Выход целевого продукта 85-1005. При РН, меньших 4,5, начинается конкурентная реакция гидролиза образующегося фосфоамида, в результате чего выход фосфоамида понижается. Существенными отличиями предлагаемого способа получения является использование в качестве нуклеотидной компоненты водораствориглых солей нуклеотидов, в качестве Раство1)ителя воды, в качестве производного карбодиимида-1-этил-3-(3-диметиламинопропил)-карбодиимид, в качестве аминной компоненты — водного раствора амина с рН 4,5-10, при условии, что РН раствора амина на 1+0,1 меньше РК амина. П р и M е р 1. К 1 мкмоль Яа-соли gpT (10 OE26o упаренный до масла водный раствор ) добавляют 100 мхл 3 N водного раствора имидазсла (pI< =7,0 ), предварительно титрованного с помощью 6 н. водной соляной кислоты до рН 6,0. Затем добавляют -10 мг (50 мкмоль ) 1-этил-3-(3-диметиламино. пропил )карбодиимида и через 2 ч при 20 С полученную смесь фракционируют о с помощью электрофореза на бумаге в 0,05 М триэтиламглонийном буфере с рН 1049498 Моно- или олигонуклеотид Концент раг ия нуклеотида,M Амин рем роесс ч ыход сфоамиФ 2 100 4 100 dpT 7, О 6,0 0,05 Имидазол Морфолин dpT 8,3 7,25 dpT Ме т илов ый эФир глицина 8,5 7,5 4,6 . 10,0 4,6 2 100 18 70 2 85 dpT Анилин Б утиламин dpT 10,9 0,05 О, 001 d(TQQ CCAA QC Tp) Имидазол 6,0 7,0 6 90 8,3 7,25 Морфолин M e T H JI O B blA эФир глицина 8,5 7,5 17 85 6 90 2 85 4 90 4,5 4,6 А нилин Имидазол Анилин (рА ) 6,0 7,0 О, 003 4,5 4,6 П р и м е ч а н и е. Во всех случаях, указанных в таблице, концентрация .карбодиимида 0,5 М, концентрация амина — 3 М,.реакционная среда — вода. Приведенный пример. К раствору амида добавляют 17 мкл (0,2 ммоль ) 4 мг (0,01 ммоль ) пиридиниевой соли морфолина и 20 мг (0,1 ммоль ) дицикdpT в 0,2 мл безводного диметилформ- 65 логексилкарбодиимида. Реакционную 7,5-8,0. Выход имидазольного производного дезокситимидиловой кислоты практически количественный. Полученное соединение идентифицируют с об- разцом, полученным ранее другим способом. П р и и е р 2. Водный раствор 8 (TQС! СС4АЬЕ Тр) N Н.+ — соли, содержащий 1 ОЕ, 10 нмоль вещества, упаривают до масла, добавляют 100 мкл 3 M водного раствора морфолина (рК „= )h =8,3), предварительно титрованного с помощью 6 н. водной НС1 до рН 7,25. Затем добавляют 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида и после выдерживания получен-(5 ной смеси в течение 5 ч при 20 С олигонуклеотидную фракцию выделяют из смеси путем гель-фильтрации на биогеле P-2. Анализ олигонуклеотидов, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменной смоле, свидетельствует о том, что морфолид декану клеотида полу чают с . выходом 904. Пример З..Водный раствор (рА-Г) в виде !.!а-соли (2 ОЕ2Ь Г, 20 йглоль ) упаривают до масла и до-, бавляют 100 мкл имидазола (рК =7,0 ) титрованного до рН 6,0 с помощью 6 н, водного раствора соляной кислоты. Затем добавляют 10 мг (50 мкмоль) 1-этил-3-(3-диметиламинопропил ) †карбодиимида и после выдерживания полу(ченной смеси в течение 3 ч при 20 С олигонуклеотиды обессоливают методом гель-фильтрации на биогеле P-2. Анализ олигонуклеотидной фракции, выполненный методом микроколоночной хроматографии на анионообменнике, свидетельствует о том, что имидазолид гептаадениловой кислоты получают с выходом 85В. Данные для других примеров получения амидов моно- и олигонуклеотидов представлены в таблице. 1049498 Составитель Л.Никулина Редактор Н.Джуган Техред С.Мигунова Корректор,А.Гяско Заказ 8359/26 Тираж 387 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 Филиал ППП "Патент", г,ужгород, ул.Проектная, 4 смесь выдерживают 3 сут при комнатной температуре и добавляют 0,5 мл воды. Через 10 ч избыток карбодиими-, дз экстрагируют эфиром, мочевину отфильтровывают и из водного слоя методом бумажной хроматографии или электрофореэа выделяют морфолид дезокситимидиловой кислоты с выходом 50Ъ.
