Способ получения сорбента для иммобилизации биологических активных веществ

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирукяцих агентом, о т л ичающийся тем, что, с целью создания сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активньин веществам, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают в -нитробензоилавидом при 2О-30°С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60С в течение 4-5 ч.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (1Щ 111) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3407134/23-05 (22) 12.03.82 (46) 07.11.83. Бвл. В 41 (72) И.К. Клявиньш и A.À. Прикулис (71) Латвийский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет им. П. Стучки (53) 661.183.123 (088.8) (56) 1. P. Cuafrecasas, Protein

purification by Affinity Chromatography, J. BioI. Chem., 1970, ч 245, М 12, р. 3059.

2. Авторское свидетельство СССР . . В 479782, кл. С 08 В 15/06, 1975 (прототип).

uS11 С 08 В 15/.06, С 08 У 5/204

С 12 Х 11/12 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ COPBEHTA

ДЛЯ ИММОБИЛИЗАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем обработки аминопроизводных простых эфиров целлюлозы модифицирующих агентом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью создания сорбентов с повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активным веществам, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают В -нитробензоилазидом при 20-30 С в течение 4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч.

". 052509

Изобретение относится к синтетической органической химии, в частности к способу получения сорбентов для иммобилизации биологически активных веществ и может быть использовано в химической промьпиленности для получения биоспецифических сорбентов с целью дальнейшего их использования в биоспецифической хроматографии новом, эффективном методе, позволяющем выделять большинство биологичес- 10 ки активных веществ с высокой степенью очистки, а также в медицине и микробиологии при проведении лабораторных исследований.

Известен способ получения сорбен- 15 та для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки исходной матрицы аминопроизводных агароэы A.-нитробензоилазидом с последующим восстановлением его нитрогруппы Щ .

Недостатком этого способа является использование в нем в качестве матрицы агарозы — дорогостоящего реагента, не -выпускаемого отечест. венной промышленностью.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем модификации аминопроизводных простых эфиров целлюлозы сероуглеродом и изобутилхлорформиатом, в результате чего получают сорбенты, содержащие изотиоциа,натные группы Г21 .

Однако эти группы пригодны лишь для иммобилизации Ферментов. Кроме того, в качестве модифицирующих агентов используются высокотоксичные вещества, такие как сероугле- 40 род и изобутилхлорформиат, в результате чего способ не имеет практического значения.

Цель изобретения — создание сорбентов с повышенной сорбционной ем- 45 костью по отношению к биологически активным веществам.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения сорбента для иммобилизации биологически активных веществ путем обработки аминопроизводных IlpocTblx.ýôèров целлюлозы модифицирующим агентом, аминопроизводные простых эфиров целлюлозы обрабатывают п -нитробензоилазидом при 20-30 С в течение

4-5 ч с последующим восстановлением нитрогруппы дитионитом натрия при

50-60 С в течение 4-5 ч.

После диазотирования полученный сорбент сочетается с широкой группой 60 соединений — ароматическими аминами, фенолами и рядом гетероциклических соединений (субстратамн, ингибыторами, кофакторами Ферментов, белками).

Лминопроизводные простого эфира целлюлозы, например аминоэтилцеллюлоза, 6-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы или 2-окси-3-(4-аминогексил) аминопропиловый эфйр целлюлоэы, обрабатывают в водном растворе диметилформамиде и -нитробенэоилазидом при 20-30 С в течение 4-5 ч, затем восстанавливают нитрогруппу полученного носителя до аминогруппы дитионитом натрия при 50-60 С в течение 4-5 ч в водной среде, причем каждые 10 г соответствующего эфира целлюлозы обрабатывают 0,525 М раствором и. -нитробензоилазидо в водном растворе диметилформамида, а при восстановлении аминогрупгыиспользугт

0,5 М водный раствор дитионита нат- рия. Выбранные соотношения компонентов реакционной смеси являются оптимальными, их изменение в сторону уменьшения приводит к уменьшению степени замещения, т.е. ухудшению свойств сорбентов, а увеличение соотношения компонентов в реакционной смеси не приводит к улучшению свойств конечного продукта и таким образом не является целесообразным.

Последующая иммобилизация биологически активных веществ протекает путем обработки полученного сорбента азотистой кислотой при 0 С в течение 0,5 ч с последующим сочетанием биологически активных веществ в течение 1 ч.

Пример 1. 50 г аминоэтилцеллюлоэы со степенью замещения

0,52 ммоль/г суспендируют в 200 мл смеси, состоящей из 120 мл 0,2 М боратного буфера рН 9,3 и 80 мл диметилформамида, затем прибавляют раствор 40,32 г (0,21 моль) и -нитробензоилазида в 200 мл диметилформамида и перемешивают при 20 С в течение

4 ч. Полупродукт и-нитробензамидоэтилцеллюлозу отфильтровывают, промывают диметилформамидом, водой и суспендируют в 500 мЛ 0,5 М раствора дитионита натрия в 0,5 М бикарбонате натрия и перемешивают при 50 С в течение 4 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой, диметилформамидом, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта 0,50 ммоль на 1 r cyхого сорбента.

В таблице показано влияние параметров синтеза на выход конечного продукта. Загрузка реагентов во всех примерах осуществляется по примеру 1.

Пример 7. Используя в качестве .исходного материала б-аминогексиламид карбоксиметилцеллюлозы со степенью замещения 0,30 ммоль/г и проводя синтез, как указано в примере 3, получают продукт со степенью замещения 0,24 ммоль/г.

Пример 8. Используя в качестве исходного материала 2-окси)пг гп<

Параметры синтеза

Примеры

20

30

4 5

50

50

0,50

0,50 0,50 0,51

0,50

ВНИИПИ Заказ 8787/17 Тираж 494 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород,ул.Проектная,4 — 3 — (ами ног . I! < нл ) il!1и н .гп ()Онилоный эфир целлюлозы со сто.пенью замещения 0,33 ммоль/г и npoBoJlR синтез по примеру 3, получают продукт со степенью замещения 0,28 ммоль/г.

Воэможности использования пблученного сорбента для иммобилизации биологически активных веществ иллюстрируются следующими примерами.

Пример 9. Иммобилизация тирамина (субстрат фермента). 10 r

Ф-аминобензамидоэтилцеллюлозы суспендируют в 200 мл 0,5 н соляной: кислоты, затем охлаждают до 0 С и прибавляют холодный раствор 5 r нитрита натрия в 25 мл воды, пере- 15 мешивают при 0 С в течение 20 мин, затем быстро отфильтровывают, промывают холодной 0,01 н соляной кислотой и суспендируют. в 250 мл холодного (О С) 0,1 н фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 8,65 г (0,05 моль) гидрохлорид тирамина

1и перемешивают при 0 С в течение

1 ч. Продукт отфильтровывают, промы. вают водой, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта

0,45 ммоль/г.

Пример 10. Иммобилиэация нуклеозидфосфатов (кофермент) 10 r -аминобензамидозтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия, как указано в примере 9, суспендируют в

250 мл холодного (О C) 0,1 и фос фатного буфера. рН 8,0, содержащего

3,91 r (0,01 моль) аденозин-5-мо, нофосфорной кислоты динатриевой со:ли и перемешивают при 0 С в течение

1 ч. Продукт отфильтровывают, промывают водой, ацетоном и сушат на воздухе. Содержание продукта 0,30 ммоль/г,, Температура взаимодействия л-нитробензоилазида с аминоэтилцеллюлозой, С 20

Время взаимодействия и -нитробензоилазида с аминоэтилцеллюлозой, ч 5

Время восстановления нитрогруппы дитионитом натрия, ч Температура восстановления нитрогруппы дитионитом натрия, С 50

Степень замещения конечного продукта, ммоль/г

Пример 11. Иммобилизация

3,4-диметокси-в-фенилэтиламина (ингибитор фермента). 10 г л -аминобенэамидоэтилцеллюлозы обрабатывают нитритом натрия по примеру 9 и суспендируют в 250 мл холодного (О С) 0,1 н фосфатного буфера рН 8,0, содержащего 1,81 г (0,01 моль) 3,4-диметокси-р-фенилэтиламина и пере4 мешивают при 0 С в течение 1 ч.Продукт отфильтровывают, промывают водой, этанолом и сушат на воздухе.

Степень превращения, судя по цветному тесту, с тринитробенэолсульфонатом натрия является количественной.

Полученные сорбенты обладают повышенной сорбционной емкостью по отношению к биологически активныщ ве- ществам,содержащей 300-450 мкмоль/г по сравнению с сорбентом по способупрототипу, у которого емкость составляет 0,5-5 мкмоль/г. Кроме того, применение новых модифицирующих агентов, обеспечивающих введение

П-аминобенэоильного остатка, позволяет получить сорбент для иммобилизации целого ряда биологически активных веществ, таких как субстраты ферментов, ингибиторы ферментов, коферменты и другие, которые невозможно иммобилизовать сорбентом,полученным по известному способу.При этом сохраняются все преимущества целлюлозного носителя. Применение новых модифицирующих агентов исключает использование высокотоксичных веществ, таких как сероуглерод и изобутилхлорформиат, являющихся в прототипе одними из компонентов реакционной смеси.