Способ выделения оксидазы @ -аминокислот из яда гюрзы

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗУ L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ЯДА ГЮРЗЫ, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием , гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100 и зфоматографию ферментсод ержащего раствора на с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором, от л и ч а ю щ и и с я, тем, что, с целью повьшения выхода и степени очистки целевого, продукта, растворение яда и гель-фильтрацию осуществляют с иСпсльзоваки 4 в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммоний рН б,4-6,6,полученный после гель-фильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед хроматографией обессоливанию диализом до уп&пъпоК электропроводности ,

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(Sl) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф

° С ъ1

050 1W 0О Ф

ГОСУДАРСТВ;ВЕННОЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21 ) 3419085/28-13 (22). 07.04 ° 82 (46) 23.11.83. Бюл. 9 43 (72) A.À. Тара, Э.Э. Аавиксаар, В.Ю. Ярве и Ю.Р. Сийгур (71) Опытный завод органического синтеза и биопрепаратов Института химии AH ЭССР и Институт химичес- . кой н биологической физики AH ЭССР (53) 677.15.07(088.8) (56) 1. Вопросы. медицинской химии и действия физиологически активных веществ. Ташкент, 1970, с. 81 -85.

2. Сахибов Д.H. и др. Выделение и .характеристика оксидазы L-аминокислот яда среднеазиатской гюрзы."Биохимия", 1973, т. 38, вып. 1, с. 216-220. (54)(57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ ОКСИДАЗЫ

L-АМИНОКИСЛОТ ИЗ ЯДА ГЮРЗЫ, предусматривающий растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию

„.su„„1055?69 А полученной надосадочной жидкости на сефадексе 0-100 и хроматографию . Ферментсо4ержащего раствора на колонке с ионообменной смолой с элюацией фермента солевыа раствором, отличающийся тем, что, с целью повыаения выхода и степени очистки целевого. продукта, растворение яда и гель-фильтрацию осуществляют с использованием в качестве буфера 0,19-0,21 М раствора уксуснокислого аммония, рН 6,4-6,6,полученный после гель-фильтрации ферментсодержащий раствор подвергают-перед хроматографией обессоливанию диализом до удельной злектропроводности .„(1,6-1,8) 10 > s ñì " (0,019 - Ф

0,021 Й) и устанавливают в нем рН

5,3-5,5, в качестве ионообменной смолы используют карбоксиметилцеплюлозу, а в качестве элюирующего ñîëåвого раствора - 0,019-0,021 М раст; вор уксуснокислого амьюния, рН

5,3-5,5.

1055769

Изобретение относится к выделению оксидазы L-аминокислот — фермента, каталиэирующего реакции окис-, лительного дезаминирования L-аминокислот с образованием еС-кетокислоты. Оксидаза L-аминокислот используется как для препаративного получения тироксина, чистых в-изомеров аминокислот о с -кетокислот, так и для различных аналитических целей при изучении процессов транспорта аминокислот в процессе синтеза белка.

Оксидаза L-аминокислот содержится во многих тканях животных (печень птиц), в микробах и в биологических жидкостях животных (змеиные 35 яды).

Получение оксидазы L-аминОкислот из тканей животных и из микробов не обеспечивает чистоту фермента,таК как источники фермента представляют 7п многокомпонентную смесь различных

:белков, разделение которых является сложной задачей. Наиболее эффективным источником фермента являются змеиные яды, так как стабиль- 25 ность структуры яда обеспечивает четкое разделение.

Активность оксидазы L-аминокислот в ядах различных змей варьируется. Это связано с видовой специфич- 3р ностью ядов, а также зависит от места обитания и условий существования змей.

Исследование ядов среднеазиатских змей показало, что наибольшей активностью оксидазы Ь-аминокислот обладафет яд гюрзы. Это и определяет выбор яда гюрзы в качестве источника для выделения фермента..

Известен способ выделения оксидазы Ь-аминокислот из яда гюрзы 40 путем растворения яда в воде, осаждения белков сульфатом аммония, гельфильтрации на сефадексе G-100 в присутствии фосфатного буфера c pll

7,8 и обессоливания Ферментной фрак- 45 ции на сефадексе G-25. Достигаемая степень очистки фермента 5,4-7,0 j1 ).

Наиболее близким по достигаемому результату и технической сущности является способ выделения оксидазы 5О

L-аминокислот из яда гюрзы, предусматривающий растворение яда в

0,05 М фосфатном буферном растворе с рН 7,8 с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полу- 55 ченной надосадочной жидкости на сефадексе 0-100. Затем фракцию, содержащую ферментативную активность, обессоливают, высушивают лиофильно и растворяют в 0,0025 М Фосфатном бу- фере, после чего осуществляют хрома- » тографию. на ДЭАЭ-целлюлозе с элюацией Фермента 4-ступенчатым градиентом NB,C1 (0,1-0,4 М) в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,8 Г2 3.

Однако слабоосновной анионит

ДЭАЭ-целлюлоза — не является селективным ионообменником при очистке оксидазы L-аминокислот. Фермент элюируется, совместно с основным количеством белка после первой ступени ионной силы (0,1 М IlaC1).Достигается только 3-кратная очистка, причем потери активности доходят до 31%. Степень очистки — 15,3 раза. Выход оксидазы L-аминокислот65,4%.

Таким образом, недостатком способа является низкий выход оксидазы L-аминокислот и невысокая степень очистки.

Целью изобретения является по- вышение выхода и степени .очистки оксидазы 1,-аминокислот.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом выделения оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, предусматривающим растворение яда в буферном растворе с последующим центрифугированием, гель-фильтрацию полученной надосадочной жидкости на сефадексе G-100 и хроматографию ферментсодержащего раствора на колонке с ионообменной смолой с элюацией фермента солевым раствором,при! чем растворение яда и гель-фильтрацию осуществляют с использованием в качестве буфера 0,19-0,21 M раствора уксуснокислого аммония, рН

6,4-6,6, получеййщй йбсле гельфильтрации ферментсодержащий раствор подвергают перед.хроматографией обессоливанию диализом до удельной электропроводности (1,6-1,8) х х 10 ЗВ ° см-" (0,019-0,21 М) и устанавливают в нем рН 5,3-5,5,в качестве ионообменной смолы используют карбоксиметилцеллюлоэу, а в качестве элюирующего солевого раствора— .0,019-0,021 М раствор уксуснокислого аммония, ptl 5,3-5,5.

Аммоний уксуснокислый является

1 очень:гигроскопичным:, веществом и с целью приготовления хорошо воспроизводимых буферных растворов необходим контроль удельной электропроводности раствора. Удельная электропроводность рассчитывается по формуле

УЭ = - (G . см )

К где К - константа ячейки кондуктометра; см Р— сопротивление раствора, Ом.

ITl

Предлагаемый способ обеспечивает повышение степени очистки до 25 раз и повышение выхода до 85% оксидаэы

L-аминокислот.

Использование уксуснокислого аммония в качестве буфера на стадии растворения обеспечивает создание среды."для последующего разделения.

1055769

Гель-фильтрации подвергают раст. вор яда гюрзы, разделение происходит на геле, причем в качестве геля используется сефадекс 0-100 сверхтонкий, разделяющий белки в пределах молекулярного веса 4000-150000 5 дальтонов. Яд гюрзы, содержащий многокомпонентную смесь, разделяется на

9 белковых пиков (см. чертеж).

III — IX пики исключаются, поскольку в них присутствуют эндонуклеазы, 10 протеазы, фосфолипазы А, токсины, яда и другие вещества; Степень очистки 5-6 раз, выход 95%.

Последующей ионообменной хроматографии подвергают фракции II пика 5 гель-фильтрации, причем удельную электропроводность .раствора уменьшают с диализом до (1,6-1,8) х х 10 S ° см ", (0,019-0,021 M) рН

6,4-6,6, одновременно концентрируя раствор до 40 мл. рН раствора доводят до 5,3-5,5 с помоцью 20%-ной уксусной кислоты. В качестве ионита используют избирательно действувцую карбоксиметилцеллюлозу и проводят селективное разделение. На ионит наносят раствор фермента .с удельной электропроводностью (1,6-1,8).10t -m

0,019-0,021 М, рН 5,3-5,5. При этом оксидаза L-аминокислот проходит ионообменник, а остальные белки связы- ЗО ваются катионитом.

Таким образом, предлагаемый способ заключается в следующем.

Яд гюрзы растворяют в растворе уксуснокислого аммония, центрифуги- 35 руют, осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гельфильтрации. Гель-фильтрацию проводят. .с раствором уксуснокислого аммония 0,19-0,21 Л с удельной электропро- 4() водностью (14 5-15,5 ) 10 s ° см рН 6,4-6,6. Полученную фракцию оксидазы L-аминокислот с приблизитель но одинаковым молекулярным весом обессоливают и концентрируют при по- 4 мощи диализа с полиэтиленгликолем до удельной электропроводности (1,6-1,8) -10 З S - сМ-", (0,019-0,021 N)

Полученный раствор фермента, рН

5,3-5,5, наносят на колонку с карбок- о симетилцеллюлозой. Оксидаза L-аминокислот проходит катионит, а остальные белки (фосфодиэстераза, щелочная фосфатаза, 5 -нуклеотидаза) связываются катионитом при рН 5,3-5,5 и удельной электропроводности раствора (1,6-1,8) - 10 S ° см., (0,0190,021 И). Фракции оксидаэы L-аминокислот собирают и концентрируют при помощи диализа с полиэтиленгликолем.

Выход = 853. Степень очистки — 25раз.66

Активность оксидазы Ь-аминокислот5 ед/мг белка.

Характеристика препаратас выход - 85. 2Ъ, степень очистки—

25,0 раза, активность оксидазы

L-аминокислот — 5,0 ед/мг белка.

Пример 2. К 5,0 г яда,добавляют 40 мп 0,2 М раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,0 ° 10 > s см-", фН 6,5. Смесь медленно перемешивают

4 ч. Растворенный яд центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин при 4 С.. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель фильтрации. На уравновешенную 0,2 М

Пример 1. К4,9гядагюрзы добавляют 40 мп 0,19 И раствора, уксуснокислого аммония с удельнбй . электропроводностью 14,5-10 3 s - см рН 6,4. Смесь медленно перемешивают в течение 4 ч при 4ОС. Растворенный яд центрифугирувт при 5000 об/мин о при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации. На уравновешенную 0,19 .И раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 14,5 10 3S -см ) колонку с сефадексом 0-100 сверхтон». ким (размеры колонки 4,2х140) наносят раствор яда., Колонку элюируют 0,19 И раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 14,5 - 10 S см-, рН 6,4, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции до 19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно спомощью "Увикорд-11".Получают

:9 белковыхпиков.Во IIпике фракции,ко торые имеют активности оксидазы L-аминокислот,объединяют (объем 200 мп) и подвергают диализу до выхода 40 мп желтого раствора белка с удельной электронроводностью 1,6 - 10 3S -см ", 0,019. И; доводят рН 20%- ной уксусной

;кислотой до рН 5,3.

Раствор фермента наносят на уравновешенную 0,019М раствором уксуснокислого аммония (удепьная электропроводность 1,6 -10 >S - см-", рН 5,3) колонку карбоксиметилцеллвлозы KM-52.

Через колонку пропускают 0,5 л раствора уксуснокислого аьиония, рН 5,3 (удельная электропроводность раствора 1,5 10" S ° .см . Скорость элюации 45 мл/ч, собираются фракции по

15 мя. Оптическую плотность элвата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда". Во фракциях определяют активность оксидаэы ь-аминокислот (субстрат - Ь-лейцин). При ионообменной,хроматографии на КМ-целлюлозе оксидаза Ь-аминокислот проходит катионит s д а нHнHы х x у с л о в иHяRхx, а остальные белки, имеюцие изоэлектрическую точку выме 5,3, связываются катионитом. Фракции, содержацие активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (выход 140 мл ) и концентрируют при помощй диализа.

1055769

45

Ф-кетокислоты. раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,0 х х 10 38 .см 1) колонку с сефадексом

0-100 сверхтонким (размер колонки

4,2х140 см) наносят раствор яда.

Колонку элюируют 0,2 И раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,0 - 10 S .см"", рН 6,5, со скоростью 13 мл/ч и собирают фракции .по 19 мп. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорд-11".

Получают 9 белковых пиков. Во II пике фракции, которые имеют активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (объем 205 мл) и концентрируют при помощи диализа до 40 мл.

Удельная электропроводность полученного раствора 1,7 - 10 S - см

0,02 И. рН раствора доводят до 5,4 с помощью 20%-ной уксусной кислоты.

Раствор фермента наносят на уравновешенную 0,02М раствором уксусно» кислого аммония (удельная электропроводность 1,7 -10 3S - см ") колонку КМ-целлюлозы. Через колонку пропускают 0 5 л 0,02 М раствора уксуснокислого аммония, рН 5,4 (удельная электропроводность 1,7 х х 10 Б-см ). Скорость элюации

45 мл/ч. Собираются фракции по 15мл.

Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикор" да". Во фракциях, содержащих белки, определяют активность оксидазы

L-аминокислот (субстрат - L-лейцИн), объединяют их (выход 145 мл) и концентрируют при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход—

85,7Ъ, степень очистки - 25,6 раза, активность оксидазы Ь-аминокислот5,4 ед/мг белка.

Пример 3. К 4,9 r яда добавляют 40 мл 0,21 N раствора уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 ° 10 s - см ", рН

6,6. Смесь медленно перемешивают

4 ч при 4 С. Растворенный яд центд о рифугируют при 5000 об/мин при 4 С в течение 30 мин. Осадок выбрасывают, надосадочную жидкость используют для гель-фильтрации. На уравновешенную 0,21 И раствором уксуснокислого аммония (удельная электропроводность 15,5 - 10" S -см ") колонку с сефадексом G-100 сверхтонким (размеры колонки 4,2х140 см) наносят раствор яда.

Колонку элюируют 0,21 И раствором уксуснокислого аммония с удельной электропроводностью 15,5 х х 10 3S - см ", рН 6,6, со скоростью

13 мл/ч и собирают фракции по

19 мл. Оптическую плотность элюата регистрируют непрерывно с помощью

"Увикорд-11". Получают 9 белковых пиков. Во. II пике фракции, которые .имеют активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (объем 200 мл ) и подвергают диализу до выхода 40 мл желтого раствора белка с удельной электропроводностью 1, 8 ° 10 S - см - . . 0,021 M. Доводят рН 20%-ной уксусной кислотой до 5,5..

Раствор фермента наносят на уравN новешенную 0,021 М раствором уксусно кислого аммония (удельная электропроводность 1,8 . 10 зs - см ") колон„ку карбоксиметилцеллюлозы KM-52, Через колонку пропускают 0,5 л

0,021 И раствора уксуснокислого ам мония рН 5,5 (удельная электропроводность раствора 1,8 ° 10 З.S -см " ). ,Скорость элк ации 45 мл/ч. Собирают фракции по 1.5 мл. Оптическую плот20 ность элюата регистрируют непрерывно с помощью "Увикорда". Во фракциях определяют активность оксидазы ,L-аминокислот (субстрат — Ь-лейцин).

При ионообменной хроматографии на

КМ-целлюлозе оксидаза L-аминокислот проходит катнонит в данных условиях, а .остальные белки, имеющие изоэлект- рическую точку выше 5,3, связываются на катионит. Фракции, содержащие активности оксидазы L-аминокислот, объединяют (выход 140 мл) и конденсируит при помощи диализа.

Характеристика препарата: выход—

85,IÚ, степень очистки — 25,2 раза,, активность оксидазы L-аминокислот

35 5,1 ед/мг белка.

Концентрированный раствор фермента полностью сохраняет активность в течение 24 мес при температуре хранения 4 С.

Определение активности оксидазы

LcwHHoKHслотв

Активность фермента оксидазы

L-аминокислот определяют с L-лейцином, который окисляется под действием фермента до сосиветствуюцей

За единицу активности оксидазы

L-аминокислот принимают количество фермента, которое окисляют 1 мкмоль

50 L-лейцина до aL-кетокислоты в мину.ту при 25 С, рН 8,5. Активность оксидазы L-аминокислот выражают по содержанию белка в препарате, которое определяется rio методу Лоури.

Технико-экономический эффект предлагаемого изобретения заключается в экономии. змеиного яда за счет увеличения качества ферментного препарата (увеличение выхода, повышение щ степени очистки). Упрощается про цесс очисТки оксидазы L-аминокислот из яда гюрзы, особенно этап ионообменной хроматографии.

Оксидаза L-аминокислот может быть использована для различных аналити1055769

Составитель О.Скородумова

Редактор Н.Егорова Техред В.Далекорей ЕорректорС. Шекмар

Заказ 9239/21 Тираж 523 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 г

Филиал ПЛП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 ческих целей при изучении процес(сов транспорта аминокислот в процессе синтеза белка (инженергенетика }, а

8 также для препаративных целей - при синтезе тироксина, чистых D-изомеров аминокислот и Ь-кетокислот.