Способ количественного определения декстринолитической активности солода
СПОСОБ КОЛИЧЕСРВЕННОГО ОПРБДЕЛБЯ11Я ДЕКСТРИНОЛИТИЧБСКОЙ АКТИВНОСТИ COJlOMA, предусматривсиосций выдел ение декстринов из сброженного Ъуела, экстракцию декстриназы из солода , ферментативный гидролиз декстринов экстрактом декстриназы и определение редуцирукчцих углеводов, образукхцихся при ферментативном гидролизе , с последующим расчетом декстринолитичёской активности, отличающийся тем, что, с целью повьшения точности -определения путем предотвращения действия на декстрины. (JL- и в -амилазы солода, вьщеленные декстрины подвергают ферментативному гищ}олиэу плесневой об-амилазой в количестве 20-20,5 ед КС/г, при 29,5Э0 ,5с в течение 175-180 мин до получения Ы-предельных декстринов, а количество солода, взятого для экстракции декстриназы, устанавливают paвны L от 0,001 до 0,020 г/мл ферментативно-З 3 го гидролизата для обеспечения прямо пропорциональной зависимости меяоду количеством декстриназы, временем ее действия и количеством образукяцихся редуцирующихся углеводов.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
ОИ Л
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ, н автоосноав сиидатввстви (21) 33&3323/28-13 (22) 19.01.82 (46) 23.12. 83, Бюл. 9 47 (72) А.Н.Пономарева, Е.A,Ñêâîðöîâà, Н.О.Илопак, И.Л.Ировенко и А.П.Рухлядева (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт продуктов брожения (53) 663.43(088.8) (56) 1. Мэннерс Д. и Йеллоулис Д.
Предельная декстриназа из проросшего ячменя. - "Крахмал", ФРГ, 1971, 23т, й» 7, с. 228.
2. Авторское свидетельство СССР
В 91465, кл. G 01 N 33/02, 1951. (54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО
ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕКСТРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СОЛОДА, предусматрива аций выделение декстринов из сброженного сусла, экстракцию декстринаэы из солода, ферментативный гидролиз декстSU„„22 A
Мд> С 12 С 7/04> G 01 N 33/14 ринов экстрактом декстриназы и определение редуцирукщих углеводов, образукицихся при ферментативном гидролизе, с последующим расчетом декстринолитической активности, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повыаения точности .определения путем предотвращения действия на декстрины, о - и з -амилазы солода, выделенные декстрины подвергают ферментативному гидролизу плесневой оС-амилазой в количестве 20-20,5 ед AC/ã, при 29,530,5 С в течение 175-180 мин до получейия aL --предельных декстринов, а количество солода, взятого для экстракции декстриназы, устанавливают равным от 0,001 до 0,020 г/мл ферментативно-ф
ro гидролизата для обеспечения прямо I пропорциональной зависимости между Ц Я количеством декстриназы, временем ее действия и количеством образующихся 1 редуцируюарюхся углеводов.
1062254
f0
35
45 дов их определения.
Опыт ° (ферментативный гидролиз субстрата ферментом ).
0,5 ми раствора декстриназы и
50 1 ми раствора с -предельных декстринов, приготовленного таким же образом, что и: в контроле, инкубируют при 30еС в течение 60 глин (при анализе просяного солода ) или 60-120 мин (при Енали:зе ячменного или овсяного солода ). Затем останавливают ферментативную реакцию, добавляя 5 ми медного реактива для определения редуцирующих углеводов и 4,5 мл воды и кипятят 20 мин на водяной. бане для
® определения редуцирующих углеводов тем же методом, что и в контроле.
Разница в содержании редуцирующих углеводов до и после ферментативного гидролиза (в пересчете на глюкоэуг
65 соответствует количеству прогидролиИзобретение относится к спиртовой промышленности, а именно к способам определения декстринолитической активности (активности фермента олиго, Ы -1,6-глюкозидаэы, или декстринаэы) солодов.
Известны способы определения декстриназы солодов,с использованием в качестве субстрата для ферментативного гидролиза полисахарида пуллулуна (1г.
Наиболее блиэкигл к предлагаемому по технической сущности является способ количественного определения декстринолитической активности солода, предусматривающий выделение декстринов из сброженного сусла, экстракцию декстриназы иэ солода, ферментативный гидролиз декстринов экстрактом декатриназы и определение редуцирующих углеводов, образующихся при ферментативном гидролиэе, с последующим расчетом декстринолитической активности, Г2 .
Недостатком данных способов является малая. точность определения.дек1стринаэы, происходящая .из-за того, что декстоины, используемые в этих способах, гидролйзуюТся сопутствующими el — и 3 -амилазами солодов.
Недостаточная точность укаэанных способов проистекает также из-за использования таких методов определения редуцирующих углеводов, которые способны определять лишь большие их коничества, т.е. макрометодов.А они требуют проведения глубокого ферментативного гидролиза декстринов. При этом нарушается прягло пропорциональная зависимость между количеством фермента, взятого на анализ, временем его действия и количеством образованных им редуцируюцих углеводов, что мешает последующему количественному расчету декстринолитическои активности солода.
Цель изобретения — повыгение точ ности .определения декстринаэы. указанная цель достигается тем, что согласно способу количественного определения декстринолитическои активности солода, предусматривающему выделение декстринов иэ сброженного сусла, экстракцию декстриназы из солода, ферментативный гидролиз декстринов экстрактом декстриназы и определение редуцирующих углеводов, образующихся при ферментативном гидролизе, с последующим расчетом дектринолитической активности, выделенные декстрины подвергают ферментативному гидролиэу плесневой d,-амилаэой в количестве 29-20,5 ед. AC/ã при
29,5-30,5 С в течение 175-180 мин до получения oL -предельных декстринов, а количество солода, взятого для экстракции декстриназы устанавливают равным 0,001-0,02 г/мл ферментативного гидролизата для обеспечения прямо пропорциональной зависимости между количеством декстриназы, временем е действия и коиичеством образующихся рвдуцирующих углеводов.
Сущность способа заключается в следующем.
Первоначально получают исходные декстрины. Их выделяют осаждением этанолом из сброженного дрожжами сусла, приготовленного из оклейстериэованного картофельного крахмала, осахаренного ячменныгл солодом четырех-, пятидневного ращения. Эти исходные декстрины дополнительно обрабатывают плесневой oL-амилазой, например препаратом Аглипоризин П10х, внося его в
10%-ный раствор исходных декстринов в количестве 20-20,5 ед. AC/г декстрина, инкубируют при 29,5-30,5 С в течение 175-180 мин, кипятят для инактивации фермента, охлаждают, осаждают этанолом и высушивают на воздухе при комнатной температуре с получением о -предельных декстринов, которые служат субстратом при определении декстринолитической активности солода. Затем из солода экстрагируют водой декстриназу.
Готовят контроль на субстрат и инактивированный фермент беэ ферменгативного гидролиза. Для этого 5-10 ми раствора декстринаэы иэ солода инактивируют 10 мин в кипящей водяной бане, охлаждают, фильтруют и отбираЬт 0,5 глл в пробирку ° Туда же вносят 1 мл предварительно нагретого до 30Î С 2%-ного раствора ol -предельных декстрииов в 0,15 гл ацетатнонатриевом буфере с рН 4,5, переглешивают и отбирают 0,5 глл в пробирку, в которую предварительно добавляют
5 мл медного реактива для определения редуцирующих углеводов и 4,5 мл воды, перемешивают и кипятят на водяной бане 20 мин для определения редуцирующих углеводов одним из микромето1062254 эовайных декстринаэой of — 1, 6-глюкозидных связей в декстринах и количественно отражает содержание декстринаэы в солоде, взятом на анализ. Это справедливо в том случае, когда гидролиэ о -предельных декстринов не преныыает 10-11% от взятого на анализ количестна. При этом разница в содержании углеводов до и после ферментатинного гидролиза пропорциональна количеству декстринаэы, взятой на 10 анализ, и нремени ее действия на о -предельные декстрины; Поэтому рас чет декстринолитической активности не требует выведения специальных корректировочных формул, а производится 15 по пропорции между количеством солода взятого на анализ, временем действия фермента и разницей в содержании редуцирующих углеводов до и после ферментативного гидролиза. 20
Расчет производится по следующей
Формуле: а
ДС=------- (ед/г ) и 180t
1 где а - разность в содержании редуцируюцих углеводов до и после ферментативного гидролиэа в 0,5 мл инкубационной смеси, взятой на определение редуцирующих угленодон, мкг глюко- 30 зы;. количество солода, вэ ятое на, ферментатинный гидролиэ, в
0,5 мл инкубационной смеси, отобранных на определение углеводов, г;
180 — молярная масса глюкозы (пересчет с мкг глюкозы в мкэкнивалентны редуцирующих групп времй ферментативного гид- 40 ролиэа, мин;
ДС вЂ” декстринолитическая активность солода, ед/ДС/г солода.
За единицу дестринолитической ак- 45 тивности принято количество фермента, катализирующее при 30 С и рН 4,7 гидролиз of -1,б-глюкозидных связей с освобождением за 1 мин 1 мкэкв. редуцирующих групп, соответствующих количеству прогидролизованных глюко. . эидных связей.
Пример. 10 кг исходных декстринов растворяют в 70-80 л горячей воды, нагренают до кипения, охлаждают до 43ОС, добавляют 10 л 1N ацетатно-натриеного буфера с рН 4,7 и 10 л раствора препарата d,-амилазы (85,2 г
Амилоризина и П10х с активностью
2350 ед.AC/ã препарата) и проводят 60 гидролиз при 40+1 С при периодическом перемешивании.
Затем фермент ицактинируют нагреванием (в течение 5 мин) до кипения, раствор декстринов кипятят при пере- 65
» мешивании 20 мин, охлаждают до 25 С и сепарируют.
Затем раствор упаривают до концентрации 4% 5 Б при 80-90 С в вакууме при 0,6-0,7 ати, охлаждают и дважды переосаждают в 80%-ном этаноле,обезвоживают ацетоном и высушивают при комнатной температуре на воздухе.
Выход of --предельных декстринон составил 25-26% от исходного. количества декстринов.
Для приготовления -раствора декст риназы 5 r сухого просяного солода экстрагируют в 50 мл дистиллированной воды и отфиЛьтровывают. Из фильт рата приготавливают рабочий раствор фермента: 15 мл фильтрата вносят н .мерную колбу на 25 мл и объем доводят до метки дистиллированной водай (рабочий раствор).
Контроль на субстрат и инактивированный фермент — 10 мл рабочего раствора фермента инактивируют н кипящей водяной бане в течение 10 мин, охлаждают и отфильтровывают.
Дия составления контрольнои инкубационной смеси в пробирку вносят
0,5 мл инактивированного растнора фермента и 1 мл 24-ного раствора
Ы-предельных декстринов в 0,15 M ацетатно-натриевом буфере с рН 4 5. При этом получают 1,5 мл контрольной инкубационной смеси с рН 4,7. для анализа редуцирующих углеводов отбирают 0,5 мл контрольной инкубационной смеси, которую смешивают с
5 мл медного реактива и 4,5 мл дис:тиллированной воды и кипятят в водяной бане н течение 20 мнн с последующим титронанием 0,.005 м тиосульфатом натрия.
Опыт (Ферментативный гидролиз субстрата ферментом ).
Для составления опытной инкубационной смеси отбирают 0,5 мл рабочего раствора фермента и 1 мп того же раствора декстринов, что и н контроле. Опытная инкубационная смесь после перемешивания растворов также имеет рН 4,7 и объем 1,5 мп.
Опытную смесь подвергают инкубации при 30 С в течение 60 мин. Затем из нее отбирают 0,5 мл для определения редуцирующих углеводов так же, как и в контроле.
Определение редуцирующих углеводов, отобранных на анализе н опыте и в контроле, производится одновременно.
Предварительно строят стандартную кривую, отражанхцую соотношение между количеством глюкозы и количеством мл 0,005 н тиосульфата, pacxopyewx на реакцию с нею.
Расчет декстринолитической активности»
Содержание солода в 0,5 мл инкубационной смеси, отобранных на опреде1062254
Предлагаемый способ
Известный способ
Определено
ДС, % от среднего
Определено
ДС, % от среднего
Ошибка определенния, %
or среднего
Взято на анализ
Ошибка определения, % от среднего
Взято на анализ солода, г солода, r
204
101i0
0,4
+104
+1,0
0,006
0,8
107
-0,7
0,012
99,3
0,024
1,2
102,8
+2 8
2„0
-60
0,030
96,7
-3,3
+54
Среднее
100
Д1,95
Среднее 100
Составитель Л.йашннина
Редактор С.Лыжова Техред M.Kóçüìà Корректор Л» Патай
° ФОе 1
Заказ 3.0159/28 Тираж 523 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5
Филиал ППП "Патент", r.ужгород, ул.Проектная, 4 ление редуцирующих углеводов в опыте и в контроле, равно:
5 г 15 мл «0 5 мл ° 0 5 мл и -- — — -- — - — -- — - — --=0 01 г
50 мя 25 мл 1,5 мл
В контроле.при определении редуци- 5 рующих углеводов на титрование пошло 14,93 мл примерно, 0,005 н тиосульфата натрия. В опыте при определении редуцирующих углеводов на титрование пошло 12,11 мл того же тиосульфата.
Разница межцу результатами титрования контроля и опыта составляет
14,93-12,112,82 мп.
Поправка к титру тиосульфата равняется.0,933.
Таким образом, разница между результатами титрования контроля и опыта составляег 2,82 ° 0.,933=2,63 мл
0,005 н тиосульфата натрия.
1) Декстрины, используемые в способе, на 11-15% гидролизуются,et-амилазой.
Это приводит к завышению величины ДС.
2 ) Метод,не точен, так как,результаты определенйя ДС зависят от количества солода, взятого на анализ.
Это количество по стандартной кривой соответствует 427,8 мкг глюкозы.
Оно отражает прирост редуцирующих углеводов в 0,5 мл опытной инкубационной смеси по сравнению с контрольной за счет действия декстринаэы солода.
Величина декстринолитической активности, исходя из этих данных, равняется:
ДС=- -- †-- 3 96 ед/г
427 8 мкг
0,01 г 180 ° 60 мин воздушйб-сухого солода.
При содержании в солоде 90% сухо3 96 100 го вещества величина ДС=- — --.-У
=4,4 ед/г абсолютно сухого вещества ,солода.
Данные по точности определения предлагаемого способа в сравнении с известным цриведены в таблице.
1 Предельные декстрины, используемые в способе, не атакуются,d -амилазой.
Поэтому она не мешает определению декстриназы.
2.1 Метод точен, так как результаты определения ДС не зависят от «оличества солода, взятого на анализ.
