Полипептиды на основе @ -лизина в качестве компонентов полипептидного комплекса,полипептидные комплексы на основе @ -лизина в качестве антигенной детерминанты диагностикума и способ получения эритроцитарного диагностикума

 

1. Полипептиды на основе L-лизина общей формулы СЛ соон СО-(СН2)2-СООН со-(СН2 -соои :п 1-9:4:1 при (Г+т):п 1:1, Т:т с мол.м. 1,9-10-8«10, аТ + т + п х 2. Полипептидные комплексы на осiHOBe L-лизина обп1ей формулы Г Т®Г 1® , .с мол.м. 1, 4-10, где CH-CO -4Wl-CH-C 0) СН2)4(СН2)2 NHСООН

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 0885 А (д1)4 С 08 G 69/10, G 01 N 33/54

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

:13

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABT0PCKOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ,13

БИБАК()ТЯ)1А (57) 1. Полипептиды на основе L-лизина общей формулы нн сн со он — сн-co) (NH — сн-с8>

ХИ (CHg)g (CH2)4 (CH2) 2

1 I 1

AH 2

NH С00Н !

СО (СН2)2 СООН

2. Полипептидные комплексы на ос нове 1.-лизина общей формулы (JLg Bjz, смолм 1 410 — 4 ° 10 где са.

A= нн — сн- co),— (m — сн-со — ын-сн-со)н

Г П (CHg)@ (СН ) (СН ) 4 (4 2

1.Н2 NH СООН

1 с0-(сн ) -cooH

Хш = I:4 — 19 при и О

a..1+m=x (21) 3362324/23-05 (22) 05.12 ° 81 (46) 07.07.86. Бюл. У 25 (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт высокомолекулярных соединений AH СССР и Институт токсикологии (72) В,К. Козлов, Л.Б, Надеждина, Г.П.Власов, Г.А.Гурьянов и Ю,А.Любимов (53) 678.541.64:539.2(088.8) (56) Карельник Б.В. Эритроцитарные диагностикумы, 1976, М,, "Медицина", с. 146-147, Т:ш = 1:4 — 19 при n - =О, 71m:n=1-9:4:1 при (Х+т):и=1:1 с мол.м, 3,10 - 8,10" в качестве компонентов полипептидного комплекTakakazu S. "Preparation of

specific Diagnostikums" — Immuno.—

chemistry, 1974, ч.11,11) 8, р. 391-394 (прототип). (54) ПОЛИПЕПТИДЫ НА ОСНОВЕ L -ЛИЗИНА

В КАЧЕСТВЕ КОМПОНЕНТОВ ПОЛИПЕПТИДНОГО КОМПЛЕКСА, ПОЛИПЕПТИДНЫЕ КОМПЛЕКСЫ НА ОСНОВЕ L-ЛИЗИНА В КАЧЕСТВЕ

АНТИГЕННОИ ДЕТЕРМИНАНТЫ ДИАГНОСТИКУМА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭРИТРОЦИТАР .НОГО ДИАГНОСТИКУМА

Х:ш:п = 1-9:4:1 при (Т+ш):n = 1:1, а I + m + n = х с мол.м. 1,9-10 -8i10, 1070885 где k = 15.-50 при P = О, à k = х, k:ð = 1:1 при k + P = х с мол.м. 3 104 — 6 104 в качестве антигенной детерминанты диагностикума.

3. Способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител, специфичных к биологически активным полипептидам, путем ковалентного связывания антигенной детерминанты с формализированными эритроцитами барана с помощью альдегида, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности диагностикума к биологическим активным L-лизинсодержащим полипептидам, Изобретение относится к области химии полимеров и медицины, а именно к полипептидам на основе L-лизина, комплексам на основе полипептидов

L-лизина в качестве антигенной детерминанты диагностикума и к способу получения эритроцитарных диагностикумов.

Указанные соединения неизвестны, и их свойства в литературе не описаны.

Известен способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител, специфичных к биологически активным полипептидам путем ковалентно "o связывания антигенной детерминанты с формализированными эритроцитами барана, в котором формализированные эритроциты обрабатывают антигеном в присутствии бис- диазобензидина в барбиталовом буфере.

Недостаток способа — невысокая специфичность диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам, Наиболее близким по технической сущности и достигаемым результатам является способ получения эритроцитарного диагностикума для выявления один объем эритроцитов барана обрабатывают 5-8 объемами 3-5Х íîãî раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,2-7,4 в течение 20-24 ч о при 4-6 С,обработанные эритроциты отделяют, вновь обрабатывают 2,02,5 объемами 36-40Х-ного раствора формальдегида в том же буфере при о

4-6 С в течение 20 ч, 18-20Х-ную суспензию полученных формализированных эритроцитов в том же буфере обрабатывают растворами полипептидных комплексов на основе L-лизина в физиологическом растворе с концентрацией 10-20 мг/мл из расчета 5-9 объемов раствора комплекса на один объем эритроцитов, к смеси добавляют

0,02 мл 12-157-ного раствора глутарового альдегида, смесь выдерживают

2-2,5 ч при 36-38 С .и 10-12 ч при о

4-6 С при постоянном перемешивании, осадок отмывают физиологическим раствором и отделяют центрифугированием, антител, специфичных к биологически активным полипептидам путем ковалентного связывания антигенной детерминанты.с формализированными эритро5 цитами барома с помощью альдегида, в котором эритроциты смешивают с глутаровым альдегидом, -добавляют обработанный бис-диазобензидийом антиген и промывают фосфатным буфером, Недостаток способа заключается также в невысокой специфичности диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам.

Целью изобретения является повышение специфичности диагностикума к биологически активным L-лизинсодержащим полипептидам.

Поставленная цель достигается новой структурой полипептидов на основе L-лизина общей формулы МН СН СО) НН-"Н-СО - 14Н-СН-СОМ !

25 (СН2)4

l (сн,), (сн2), ! 1Н2

ИН С00Н !

СО-(СН2)2-СООН

1070885 4 сов на основе . . лизина общеь формулы с мол,м. 1,4 ° Π— 4 .10+ где

A= $ NH СН-CO NH CH С01 -(ЫН-СН-CO -„

I t (СН2}4 (CH2) 4 (СН21 2

I I I

МН2 NH СООН

CO — (CH2)2 — СООН (СНД4

1 (С! "г г

СООН

15-50 при р =. О, k = х; .k p = 1:1 при k + p = x

4 с мол.м. 3 ° 10 — 6 10, которые являются антигенной детерминантой эритроцитного диагностикума, а также тем, что в способе получения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к биологически активным полипептидам путем ковалентного связывания антигенной детерминанты с формализированными эритроцитами барана с помощью альдегида один объем эритроцитов барана обрабатывают 5-8 объемами 3-5Х-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,27,4 в течение 20-24 ч при 4-6 С, обработанные эритроциты отделяют, вновь обрабатывают 2,0-2,5 объемами 3640Х-ного раствора формальдегида в том же буфере при 4-6 С в течение о

20 ч, 18-20Х-ную суспензию полученных формализированных эритроцитов в том же буфере обрабатывают раствбром полипептидных комплексов на основе L-лизина в физиологическом растворе концентрации 10-20 мг/мл из расчета 3-9 объемов раствора комплекса на один объем эритроцитов, к смеси добавляют 0,02 мл 12-15Хного раствора глутарового альдегида, смесь выдерживают 2-2,5 ч при 36о o

38 С и 10-12 ч при 4-6 С при посто45

55 где I:m = 1:4-!9 при п = О;

I:m:n = 1-9:4:! при (I+m): n =1:1 с мол.м. 3 10 - 8 .!О, которые слу 3 . 4 жат компонентами комплекса, новой структурой полипептидйых комплекс мол.м. 1,9 10 — 8 10 где I:m = 1:4-19 при п = О

1 а I+m=x, I:m:n = 1-9:4:1 при (I+m) .и = 1:1, а I+m+ n = x.

В=- NH СН вЂ” CO)K NH — СН-COW ! P

40 янном перемешивании, осадок отмывают физиологическим раствором и отделяют центрифугированием.

Пример 1. К раствору

0,125 г поли-L-лизина в 25 мл 0,1 м фосфатного буфера с рН 6,5, охлажденному до 0-5ОС, при перемешивании добавляли раствор 1 г янтарного. ангидрида в 10 мл диоксана. При этом рН раствора поддерживали добавлением 10Х-ного раствора Na0H в пределах

6,5-6,8,. После добавления всего количества янтарного ангидрида смесь перемешивали еще 1 ч при 0-5 С, sao тем выдерживали сутки в холодильнике. После проведения диализа против воды сополимер выделяли лиофилизацией I:m = 1:4-!9, n = О, мол,м.

= 8 10 — 8 10 . Содержание азота (элементный анализ), Х: 8,74; 8,85.

Это соответствует 80-82Х замещению аминогрупп в исходном полимере— поли-Ь-лизине, Пример 2. В условиях примера 1 из поли-L-лизина с мол.м, 1,9 10 получали полипептид,имеющий

I:m = 2:13 с мол.м. 3,2, )О . Содержание азота (элементный анализ),X:

10,38; 10,40, что соответствует 85Х замещению аминогрупп в исходном полимере.

Пример 3. Поли-L-лизин-Lглутамат с мол.м. 3 "10 — 6 10 (Х:n — "

4 4

1:1 при m = О) сукцинилировали при том же соотношении аминогрупп и янтарного ангидрида, как в примере I.

Получен сополимер с I:m=1:4-9 р 4 (Х+ш):n = 1:1 с мол.м. 4 10 — 8 ° 10

Содержание азота (элементный ана лиз), Х: 9,01; . 9, 00. Это соответствует 86,2Х замещению аминогрупп лизина в сополимере. приведены в таблице .

Пример 4. .Получение комплексов полипептидов. К 0,10 мл ,1Х-ного раствора поли-L-лизина (компонент В, k = -15-50 при р

= О, x = K) с мол.м. 7 10 - 6 10 в фосфатсодержащем физиологическом растворе с рН 6,8 (0,1 мол.фосфатный буфер) добавили 0,1 мл 1Х-ного раствора сукцината полилизина (компонент А, Х:m = 1 4-19 при п = О, Х + m ... = х) в буферном растворе при 20 С и выдерживали 5 мин. Полученную смесь наносили на колонку (52 х 1,5 см), заполненную сефадексом G = 150, и элюировали тем же буферным раствором.

Колонка предварительно была прокалибрована по следующим белкам: инсулин (мол.м, бх10 ); лизоцим э ° (мол.м. 14х10 ); гемоглобин (мол.м.

67х10 ); альдолаза (мол.м. 147х10 ) .

При проведении гельхроматографии сначала выходил пик, содержащий целевой комплекс с объемом задержки

26,5 мл, Второй пик с объемом задержки 27,2 мл соответствует полиL-лизин. сукцинату, третий — с объемом задержки 28 7 мл содержит полиФ

3.

L-лизин. Мол,м. комплекса 1,4 10—

4 10, интервал стабильности комплекса 3,5-7,5.

Пример 5, В условиях примера 4 получали комплекс поли-L-лизина (компонент В, k = 15-50 при р = О, k = х) с мол,м, 1,9 i10 и поли-L-лизин-сукцината (компонент

А, I:m = 1:4-19 при n = О, I + m = э

= х, с мол,м. 3,2 ° !О, 85Х замещенных аминогрупп) . Получен комплекс с мол.м. 1,4 10, стабильный при рН = 3,5-7,5.

Пример 6. К О,! мл 1Х-ного (раствора поли-L-лизин-L-глутамата с мол.м. от Зх10" до 6xl0, IP) в боратном буфере с рН 7,2 (компонент В, k p = 1:1 при Ы + р = х) в фосфатсодержащем 0,1 мол.буферном растворе с рН 7,2 при 20 С добавили

0,10 мл lX-ного раствора в том же буфере поли-Ь-лизин-Ь-глутамат-сукцината с мол.м. 4 10 - 8 10, 8612Х замещенных аминогрупп, (компонент

А, 7:т:п = 1-9:4:1 при 1 + m) n =

1:1, Х + m + n = х). Реакционную смесь выдерживали 10 мин и переносили на колонку для гельхроматографии (52х1,5 см), заполненную сефадексом G = )50. Целевой комплекс имеет

1070885 6 объем задержки 26,9 мл, поли-L-лизин-L-глутамат-сукцинат характеризуется объемом задержки, равным

29,3 мл, а поли-L-лизин-глутамат—

30,2 мл. Комплекс стабилен в облас.ти рН 3,5-7,5.

Определенная мол.м, комплекса не является просто арифметической суммой молекулярных. масс его компо-!

О нентов. Более низкое значение мол,.м. свидетельствует об изменении пространственной структуры и заряда, так как метод гельхроматографии позволяет непосредственно оценивать размер

15 макромолекулы.

Пример 7 (сравнительный), К 5 мл отмытых бараньих эритроцитов добавили 25 мл 5Х-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН

7,4. Смесь выдерживали 20 ч в холодильнике, затем обработанные таким образом эритроциты отделяли фильтрованием и обрабатывали 10 мл холодного 40X-ного раствора формальдегида в течение 24 ч. Затем эритроциты отфильтровывали, отмывали избытком физиологического. раствора и хранили в том же растворе при рН 7,2.

4 мл 20Х-ной суспензии формалинизированных эритроцитов барана в фосфатсодержащем физиологическом растворе (0,009 моль фосфата и

0,10 моль NaC1, рН 7,4) разливали по 1 мл в 4 пробирки, При 20 С с перемешиванием медленно добавляли в каждую пробирку по 9 мл раствора поли-L-лизина с мол.м. 7 10 — 6 1О э 4

m = О, и = О с концентрацией 0,5;

1,0; 2,0 мг/мл в том же фосфатсодержащем физиологическом растворе, К полученным реакционным смесям при 37 С с перемешиванием прикапыо вали по 0,02 мл 12,5Х-ного водного раствора глутарбвого диальдегида.

Смеси перемешивали 2 ч при +37 С, о затем выдерживали беэ перемешивания при +4 С в течение 12 ч. Осадок в каждой пробирке отмывали 5 раз физиологическим раствором с центрифугированием и использовали в реакции нейтраминидазы с гемагглютинином (РНГА) в виде 1Х"ной суспензии в

1Х-ной кроличьей сыворотке, 1Х-ном растворе альбумина человека, 1Х-ном полиглюкине (все в физиологическом растворе, содержащем фосфатный буфер с рН 7,2). Данные по реакции РНГА

1070885

П р и и е р 8, В условиях примера 7 готовили диагностикум, где в качестве антигенной детерминанты был взят поли-L-лизин-сукцинат (получен в примере 1). Данные по РНГА приведены в таблице. ъ

Hp и м е р 9. В условиях примера 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминанты брали поли-L-лизин-L-глутамат

4 (получен по примеру 3)с мол.м, 3 10—

6 ° 10 .. Данные по РНГА приведены в табл.

Пример 10. В условиях примера 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминанты был взят поли-L-лизин-L.†ãëóòàмат сукцинат с мол.м. 4 i10 (получен

4 по примеру 3) . Данные РНГА приведены в таблице.

Пример .11 (сравнительный)

В условиях примера 7 готовили диагностикум, в котором в качестве антигенной детерминанты был взят полиL-лизин с мол.м. 1,9 10 (m. О, 3

n = О) . Данные по РНГА приведены в таблице.

Пример 12. В условиях примера 11 получили эритроцитарный !

О диагностикум, содержащий в качестве антигенной детерминанты поли-Lлизин сукцинат с мол.м. 3,2 ° 10 з полученный по примеру 2. Данные по РНГА приведены в таблице, 15 Пример 13 (сравнительный).

В условиях примера 7 получили эритроцитарный диагностикум, применяя в качестве антигенной детерминанты бычий сывороточный альбумин. Дан.20 ные по РНГА приведены в таблице.

1070885

45

Корректор Г. гешетник

Техред Л.Олейник

Редактор П, Горькова

Заказ 3724/1 Тираж 515 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, Все полученные диагностикумы (кроме примера 13) неспецифически агглютинируют в использованных для

РНГА реакционных средах и непригодны для определения специфических антител.

Пример 14. К 5 мл отмытых бараньих эритроцитов добавляли 40 мл

ЗХ-ного раствора формальдегида в фосфатном буфере с рН 7,2. Смесь выдерживали 24 ч в холодильнике.

Затем предобработанные эритроциты отделяли фильтрованием и обрабатывали 12,5 мл охлажденного 36Х-ного раствора формальдегида в течение о

20 ч при 5 С. Затем эритроциты отфильтровывали, отмывали избытком физиологического раствора и хранили в том же растворе при рН 7,4.

Из 0,74 мл формалинизированных эритроцитов получали 4 мл 18Х-ной суспензии в фосфатсодержащем физи— ологическом растворе (0,075 моль фосфата и 0,15 моль NaC1, рН 7,2).

Суспензию по 1 мл разливали в 4 пробирки. При 20 С в каждую пробиро ку добавляли по 9 мл раствора полиL мерного комплекса поли-L-лизин-поли L-лизин-сукцинат (получен в примере 4 при содержании комплекса 0,2;

0,5; 1,0 и 2,0 мг/мл в физиологи- ческом растворе с концентрацией фосфатов 0,075 моль в 0,1 мол растворе NaC1 при рН 7,2.

К полученным реакционным смесям о при +36 С с перемешиванием прибавляли 0,02 мл 15Х-ного водного раствора глутарового диальдегида. Смесь перемешивали 2,5 ч при 36 С и выдерживали в течение 10 ч при +6 С. Осадок в каждой пробирке отмывали 6 раэ физиологическим раствором с центрифугированием. Отмытый эритроцитарный диагностикум стабилен в течение

2-3 месяцев при хранении (+4 С)

Для использования в РНГА диагностикум суспендировали в виде 1Х-ной суспензии в 1,5Х-ной кроличьей сыворотке, 1Х-ном растворе альбумина !

t5

40 человека, I Æ-ном полиглюкине (все растворы получены на основе физиологического фосфатсодержащего буфера с рН 7,4).

Данные по РНГА приведены в таблице, диагностикум неспецифически не агглютинировал и был пригоден для определения специфических к поли-Lлизину антител.

Пример 15. В условиях прима ра 14 получили эритроцитарный диагностикум с ковалентно присоединенным комплексом поли-L-лизин-L-глутаматполи-L-лизин-L-глутамат-сукцинат (получен в примере 6). Полученный эритроцитарйый диагностикум неспецифически не агглютинировал в использованных в РНГА средах и был пригоден для определения антител, специфичных к поли-L-лизин-L-глутамату. Диагностикум стабилен при о хранении (+4 С) в течение 2-3 месяцев.

-Пример 16. В условиях примера 14 получили эритроцитарный диагностикум с эритроцитами барана, формалинизированными в условиях примера 7. При этом в качестве антигенной детерминанты использовали комплекс поли-L-лизин-поли-L-лизинсукцинат,полученный по примеру 5 с мол.м..

1,4х10, при концентрации 0,1, 0 5 Э

1,0, 2,0 мг/мл в фосфатсодержащем буферном растворе (0,08 моль фосфата и 0,15 моль/НаС1) с рН 7,2. Диагностикум был стабилен в течение о

2-3 месяцев при хранении при +4 С.

Диагностикум неспецифически не агглютинировал в РНГА и был пригоден для выявления специфических к полилизину антител.

Таким образом, изобретение позволяет получать эритроцитарные диагностикумы, специфично определяющие в РНГА антитела к полипептидам, содержащим L-лизиновые звенья, и может быть использовано в иммунологических исследованиях.