Способ получения 3-0/ @ - @ -глукуронпиранозил/- соясапогенола

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 {B -DгаУКУРОНПИРАНОЗИЛ )-с6яСАПОГЕВОЛА В формулы -OR СООН о т л и ч а ю ц и и с я тем, что микроорганизм Stachybotrys sp. щтсшм Т-791 выращивают в -аэробных условиях в пятательной сре«е, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли в следы микроэлементов/ ПРИ РН 3,5-11,5 и температуре 15г-38 С с после(Д юпе1м выделеиием целевого продукта из культуральной и при необходимости переводят в соль.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СО(ф1АЛИСТИЧЕСКИХ .

РЕСПУБЛИН ф(Я) С 12 P.7 0

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTKPbIT14A ю (21) 2745040/28-13 (22) 30.03. 79 (31) 38536/78 (32) 31.03.78 (33) Япония (46) 15.02 ° 84 ° Бюл. В 6 (72) иасанао сннохара, еснмаса накано, Хироцугу Каисе, Такетоси Изава н Васеи Ииязаки (Япония) (7l) Оцука Фармасьютякал К.О. ЛТД (Япония) (53) 616022.12(088 8) „.SU„„0 44 A

:(54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3-0 (ф"-В-.

ГЛУКУРОНПИРАНОЗИЛ )- СОЯСАПОГЕНОЛА В

Формулы сн ок отличающийся тем, что микроорганизм Stachybotrys sp. щтамм

Т.-791 выращивают в -аэробных условнях в питательной среде, содериащей источники азота и углерода, мине- Я ральные соли и следм микроэлементов, при рН 3, 5-11, 5 и температуре .15-.38 С с последующим выделением целевого продукта из культуральной среды и при необходимости переводят

Ф

В соль °

1074408

Изобретение относится к химикоФармацевтической промышленности и касается производства терапевтических средств, которые могут быть использованы в медицине при аутоиммунных и равматических заболеваниях.

Предложенный способ новый, .в патентной и научно-.технической литера туре не описан.

Целью изобретения является получение 3-0 (P-D-глукуронпиранозил)— соясапогенола Bf.

Способ получения 3-0, (P-D-глукуронпиранозил)-саясапогенола В общей

Формулы — 0

ОН

НО он С}4 заключается в том, что микроорганизм

Stachybotrys sp. штамм T-791 выращивают в аэробных условиях в питательной среде, содержащей источники азота и углерода, минеральные соли и следы микроэлементов, при рН 3,5i1 5 и температуре 15-38 С с последующим выделением целевого продукта из культуральиой среды и при необходимости переводят в соль.

Штамм Stachybotrys sp. T-791 для получения предложенного соединения был выделен из почвы в Tokushima

City, Tokushina, Japan.

Штамм Stachybotrys sp. T-791 хранится в научно-исследовательском институте ферментации Agency of In-.

dustrial Science and Technology, Japan (N 8-1 Inaga Higashi Schome, Chiba-shi, Уарап, под депозитным номером FSRm-p 3803, а также в Американском собрании типов культур—

12301 Park lawn Drive Rockville, Maryland 20852 — пад номером ATCC

20513) .

Культуральные признаки.

Солодовый экстракт агара.

Рост быстрый и неравномерный.

Субстратный мицелий от рыжевато-коричневого до темно-коричневого. Колония плоская, образование конидий хорошее. Цвет гиф от светло-коричневого до рыжевато-коричневого, наблюдаются капельки жидкости, которая выделяется. Растворимый пигмент не продуцируется. К ртофельная глюкозная среда

Рост очень быстрый и при выра вании при 27 С в течение 30 дней колония достигает размера 70 мм. ПериФерическая часть колонии вытянута древовидно, наблюдаются прикреплен55

Получают 3-0 (P-D-глукуронпиранозил) — соясапогенол В следующим образ ом.

Сначала штамм Stachybotrys sp.

T-791 выращивают в питательной среде, содержащей обычные источники питания и добавки. В качестве питательного субстрата обычно используются источники азота, например соевая мука, соевое масло, экстракт от замачивания зерновых, дрожжевой экстракт, сухие дрожжи, толокно, ные к субстрату белые гифы. Видно большое количество мелких капелек жидкости. Субстратный мицелий светло-желтый. Растворимый пигмент не образуется.

5 Агаровая среда чапека.

Рост колонии слабый.

Синтетическая слизистая агаровая среда.

Рост колонии слабый.

10 Агаровая среда на овсяной муке.

Рост колонии очень хороший . Колония тонкая и плоская. Образование гиф обильное от начальной стадии выращивания, конидии образуются так 5 же быстра. Цвет колонии изменяется от белого до темно-коричневого в процессе культивирования. Большое, количество жидких капелек появляется на гифах. Растворимый пигмент не обра20 зуется

Морфологические свойства.

Фиалофоры просто разветвлены и стоят пряма. Фиалофорные окончания слегка утолщены в виде розги. Однако утолщение незначительно. Эти штаммы имеют гифы шириной 4,0 — 4,5 микрон, что несколько превышает ширину фиалофор. Фиалофоры, которые прямо ответвляются с опорными клетками от вегетативных. или от воздушных гиф, имеют от двух до трех .перегородок и размеры .40-80 ° 3,0-3,5 мик рон. Клеточная стенка фиалофор не мелкоигольчатая, а гладкая. От трех до шести фиалид отходят от утолщенной части окончаний фиалофор. Кроме того, сферические и имеющие форму сплюснутых шариков фиалофоры од ной клетки, имеющие мелкоигольчатый выступ и размеры 4,3-5,2 «3,0-4,2

40 мйкрон, постоянно образуются безипетально от окончания фиалид, формируется цепочка конидий от 24 до

70 штук. Фиалида имеет обратную буЛавовидную форму и размеры 6,9-10,7

45 3,5-4,7 микрон. Фиалофоры и фиали да бесцветны, а фиалида окрашена в цвет от кофейного до черного.

Физиологические свойства.

Stachybotrys sp. Т-791 является

50 . аэробным штаммом.

Условия выращивания: рН 3,5-11,5, темп 15-38 С. Оптимум роста: рН 4,99,5, температура 20-30С С.

1074408 мясной экстракт, гидролизованный казеин, соли аммония и нитраты. Подходящими источниками углерода являются глюкоза, глицеролмальтоза, крахмал, лактоза, сахароза и меласса.

Добавки к культуральной среде содержат такие вещества как карбонат кальция, хлорид кальция, сульфат маг.— ния и фосфорную кислот . Если необходимо, то культуральная среда может содержать очень маленькие добав- 10 ки солей металлов, таких как желе- . зо, медь, магний и цинк. Выращивание проводят в обычной водной среде, содержащей упомянутый субстрат, с, использованием поверхностного или глубинного культивирования с аэрацией и перемешиванием. Предпочтительно глубинное выращивание с аэрацией и перемешиванием.

Культивирование проводят при

15 — 38ОС, предпочтительно при 20о

32 С,. в течение 3 - 7 дней в условиях обычной аэрации и при поддержании рН культуральной среды 3,511,5, предпочтительно 4;5 — 9,5.

По завершении выращивания полученное вещество выделяют из питательндй среды различными известными .методами. Выделение может быть осуществлено, например, методом, использунияим различия .в растворимости между продуктами и примесями, или методом, использующим различие в адсорбционной способности и средстве с обычныи абсорбентами, такими как активированный уголь ХАД-2 силикагель, ионообменные смолы, сефадекс и т.п., или методом, использующим различия в коэффициенте растпэеделения между двумя жидкими фаза-.. ми, и сочетанием таких методов. 40

Соединение может быть получено в виде солей с различными Фармацевтически приемлемами основаниями.

Соединения могут быти использованы как терапевтические средства 45 при нефритах, В этом случае они могут быть в виде Фармацевтических составов и вместе с обычными фармацевтически приемлемами носителями °

Подходящими носителями,. которые могут быть использованы, являются, на пример, раэбавители или наполнителй», наполнители для увеличения объема, связующие и смачивающие агенты, деэинтеграторы, поверхностно-активные вещества и смазки, которые обычно применяются для приготовления таких лекарств, в зависимости от дозированной форма.

Различные дозированные форма терапевтических агентов для,лечения нефритов можно выбрать в соответствии с целями лечения. Дозированными формамй, которые могут быть использованы, являются таблетки, пилюли,. порошки, жидкие препараты, суспен= зии, эмульсии, гранулы, капсулы, суппозитории и препараты для инъекции (растворы, эмульсии, суспензии и тому подобное) .

При приготовлении Фармацевтического состава, содержащего соединения согласно изобретению и в качестse активного ингредиента, в форме таблеток может быть использован широкий спектр. носителей, известных в данной области. Подходящими носителями, являются лактоза, белый сахар, хлористый натрий, глюкоза, мочевина, крахмал, углекислый кальций, каолин, кристаллическая целлюлоза, кремниевая кислота, связующие, такие как вода, этанол, пропанол, простой сироп, глюкоза, раствор крахмала, раствор желатина, карбоксиметилцеллюлоза, метилцеллюлоза, фосфат калия и поливинилпирроллидон, дезинтегра1оры, такие как сухой крах-. мал, альгинат натрия, порошок агара, порошок ламинарии, кислый карбонат натрия, карбонат кальция, твин, лаурилсульфат натрия, моноглицерид стеариновой кислоты, крахмал и лактоза, ингибиторы дезинтеграции, такие как белый сахар, глицериловый эфир, стеариновой кислоты, масло какао и гидрогенизированные масла, промоторы абсорбции, такие как четвертичные основания аммония и лаурилсульфат натрия, увлажнители, такие как глицерин и крахмал, адсорбенты, такие как крахмал, лактоза, каолин, бентонит и кколлиодная кремниевая кислота и смазки, такие как очищенный тальк, соли стеариновой кислоты, порошок борной кислоты, мак-, роголь -и твердый полиэтиленгликоль.

При прессовании фармацевтического состава в форме пилюли могут быть использованы самые разнообразные обычные известные носители. Подходящими носителями являются.глюкоза, лактоза, крахмал, масло какао, твердеющие растительные масла, каолин, тальк, связующие, такие как порошок аравийской камеди, порошок трагеканта, желатин и этанол и дезинтеграторы, такие как ламинария и агар. Таблетки при желании могут быть покрыты одним, двумя и более слоями например покрытые сахаром таблетки, с желатиновым покрытием, пленочным покрытием и таблетки с покрытием, растворимым в кишечнике.

При прессов анин фармацев тического состава в суппозитории могут быть использованы разнообразные носители, известные в технике . Подходящими носителями являются полиэтиленгликоль, масло какао, высшие спирты, эфиры высших спиртов, желатин н полусинтетические глицериды.

1074408

Испытываемое соединение

Острая ток-, сичность

ЛД,. м./Антикомплемен тари а я активность, Более 300

Более 300

500-1000

0,5

1,0

0,2

0,5

0,1

0,2

Если фармацевтический состав готовят,в форме препарата для инъекции, то полученный раствор и суспензию стерилизуют, они должны быть изотоническими, по отношению к крови, При приготовлении фармацевтического состава в форме раствора или суспензии могут быть использованы все известные разбавители, Подходящими разбавителями являются вода, этиловый спирт, пропиленгликоль, этоксилиРо- 10 ванный изостеариловый спирт, сорбит полиоксиэтилена и эфиры сорбитана.

Хлористый натрий, глюкоза или глицерол могут быть введены в терапевтический препаРат для лечения нефрита в количестве, достаточном для получения изотонического раствора. Терапевтический препарат может содержать вспомогательные средства для растворения, буферы, болеутоляющие агенты и противостарители и что также Во3можно, красящие агенты, ароматичес кие, вкусовые, освежающие и другие вещества.

Количество соединения, вводимого в качестве активного ингредиента в фармацевтический состав препарата для,лечения нефрита, не лимитируется и может варьироваться в широких пределах.

Подходящим терапевтически эффек- 30 тивным количеством соединения обычно является 1-70 вес.Ъ, предпочтительно 5-50 вес.Ъ от всего состава, Антикомплементарный агент, например при лечении нефрита, в лечеб- 35 ный препарат может вводиться различными путями, приемлемыМи в зависи-мости от формы лекарственного препарата. Иапример, таблетки, пиллюли, жидкие препараты, суспензии, эмульсии, гранулы, капсулы вводят через рот. Препараты для инъекции вводят внутривенно, либо один, либо вместе с вспомогательными агентами, обычными в таких случаях, например 45 с глюкозой и аминокислотами. Кроме того, если необходимо, лекарственный препарат может быть введен внутримышечно, подкожно, внутрибрюшинно, внутрикожно. Суппозитории вводят интраректально.

Дозу препарата при лечении нефрита выбирают в зависимости от цели лечения, симптоматики и т.п. Обычно применяют дозу соединения 0,520 мг/кг веса тела в день. 55

Соединения обладают антикомплементарной активностью и используются в качестве лечебных средств при аутоиммунных заболеваниях, болезнях коллагена и ревматических заболева- 60 ниях.

Фармакологические испытания. о

Испытываемые соединения.

A 3-0-(P-D-глукуронпиранозил) -соясапогенол B. 65

В Глицирризин (соединение для сравне- ния) .

Антикомплементарная активность.

Антикомплементарную активность определяют следующим образом.

В пробирку загружают по 0,5 мл водной дисперсии каждого из испытываемых соединений, по 0,5 мл сенсибилизированных эритроцитов (сэ), пРи этом культура содержит 1 ° 10 клеток/1 мл пятикратно разбавленного буфериого раствора веронала, содержащего изотонический Желатин (этот пятикратно разбавленный раствор для краткости назван ЖВБ) и по 0,5 мл комплемента сыворотки (комплемент морских свинок), разбавленíorо

150 раз ZKBB ° Смесь выдерживают при37 С в течение б0 мин. Затем к ней добавляют 5 мл ледяного физиологического раствора и центрифугируют.

Спектральная поглотительная способность отдельного верхнего слоя определяется при ОП 413, измеряется степень ингибирования гемолиза сенсибизированных эритроцитов испытываемыми соединениями. Значение ингибирующей гемолиз активности (II /мл), изме-, ренное описанным методом, показано в табл. 1 для каждого испытываемого соединения. .Острая токсичность.

Острая токсичность (3ЩО мг/кг ве са) испытываемых соединений была определена на мышах при внутрибрюшинном ввВдении соединения A и внутривенном введении соединения В.

Полученные результаты показаны в табл. 1.

Пример 1. В 500 мл колбу

Sa kyguchi загружают 100.мл культуральной среды и штамм Stachybotrys

sp. Т-791 культивируют при 25оС, РН 5,5 в течение 4 дней при встряхивании. Культуральная .среда содержит, В

Глицерол . Крахмал

Сахароза

Порошок сои

Пентон

Экстракт солода

1074408

750

ВНИИПИ Заказ 400/56 Тираж 522

Подписное юю

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул.Проектная, 4

Сульфат магния 0,3

Соляная кислота 0,05

30-литровый. ферментационный сосуд загружают 20 л культуральной среды укаэанного состава и полученную в колбе культуру выращивают в культу ральной среде при 28оС в течение

5 дней при перемешивании со скоростью 300 оборотов .в минуту и скорости аэрации 1 литр на литр культуральной среды в минуту. Полученный куль- 40 туральный бульон.центрифугируют со скоростью 8000 оборотов в минуту для удаления микробных клеток, а рН поверхностного слоя устанавливают равным 1 кснцен грированной соляной кис- 15 лотой. Полученные проципитаты собирают центрифугированием и экстрагируют.метанолом.

Как видно из табл. 1, значение .сотрой токсичности (Jg(50 ) соединения поззоляет применить его в качестве лечебного препарата.

Фракцию метанола адсорбируют на колонке с активированным углем

:(500 мл) после ее упаривания при пониженном давлении., Колонку элюируют . водным 30%-ным раствором ацетона, а затем водным 50%-ныи раствором ацетона. Фракцию 503-ного водного раство- . ра ацетона собирают н упаривают досуха в вакууме. Остаток адсорбируют на колонке силикагеля и проявляют смесью хлороформа и ацетона (в объемном отношении 2:1 и 1:1) в качестве

Подвижной фазы. С другой стороны фракцию, содержащую 3-0 (p-D-глуку- З5 роипиранозил)-соясапогенол В", соответствующую фракции, имеющей значение Rg--0,38; полученной тонкослойной хроматографией на силикагеле Kiesel Yel F<>4 с использованием 40 смеси хлороформа метанола и воды (в объемном отношении 65:35:8) в качестве элюирующего раствора, собирают и концентрируют досуха при пониженном давлении. Концентрат сно- 45 ва адсорбируют на колонке силикаге- . ля и элюируют смесью хлороформа с .ацетоном поочередно (s объемных отношениях 2i2 и 1 1) и фракцию, соотвЕтствующую описанной, отбирают и концентрируют досуха. Кристаллизацией остатка из смеси хлороформа.с ацетоном (в объемном отношении 1:1) получают 46 мг 3-0 (p-D-глукуронпиранозил)-соясепогенола В.

Т.пл. 231-232 (с разложением) . . 55

П р и и е р 2. Берут следующие количества, мг:

Натриевая соль соединения 500

Глюкоз а 250

Дистиллированная вода для инъекции до общего объема 5 мл

Натриевую соль соединения и глюкозу растворяют в дистилированной воде для инъекций в 5 мл ампуле °

Воздух заменяют азотом, ампулу нагревают при 121 С в течение 15 мин для.стерилизации раствора и получают пригодный для инъекций препарат.

Пример 3. Берут следующне количества, мгг

Соединейие согласно изобретению

Полусинтетическое глицеридное основание для общего веса 2000

Соединение согласно, изобретению добавляют к полусинтеткческоиу осно- . ванию глицерида, смешивают их и суспендрут при -5ООС. Продукт наливают в форму и оставляют для охлаждения в.естественных условиях.

Продукт вынииают и.получают суппозиторий.

Пример 4. Верут следующие количества, r Соединение согласно

Изобретению 150 . Авицел (коммерческое название продукта, выпускаемого Asahi, Kasei Kubashiki Kaisha) .

Крахмал зерновых культур . 30

Стеарат магния 2

TC-5 (коммерческое название оксипропилиетилцеллюлозы) l0

Полиэтиленгликоль Э

Касторовое масло 40

Метанол . 40

Соединение согласно изобретению, авицел, крахмал и стеарат магния смешивают и растворяют в порошок, затем таблеттируют с использованнем обычного сахарного порошка (пудры) для получения покрытия. Полученные таблетки покрывают составом из

TC-5, полиэтиленгликоля 6000,касторового масла и метанола и получают таблетки с пленочным покрытием.

Предложенный способ позволяет по- лучить 3-0 ((-D-глукуронпиранозил)соясапогенол, используеьый в медицине .в качестве лечебного препарата.