Способ определения антиоксидантной активности веществ

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИ- I ОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ, включакяций взятие крови, введение испытуемого ветдества и раствора окисленного олеата с последующей регистрацией эритрограмм, отличающийся тем, что, с целью повышения точности измерений, испытуемое вещество вводят перитонеашьно животному и антиоксидантную активность определяют по соотношению между двумя стадиями гемолиза эритроцитов-) окисленным и неокисленным олеатом.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

П9) (И) ЗС59 61 В 5 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГГИЙ

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2925645/28-13 (22) 10.03.80 (46) 15.06.84. Бюл. 9 22 (72) Н.М.Митрохин, IO.В.Голиков, В.В.Юртаев и Э.Я.Каплан (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 615.5 (088.8) (56) 1. Владимиров Ю.А., Арчаков A.È.

Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. N. "Наука", 1975, с.245.

2. Гоненко В.A. Влияние экстрактов, фракций и некоторых индивидуаль. веществ природного происхождения на скорость гемолиза. Автореф. на соиск. учен. степени канд.биол. наук, Владивосток, 1975 (прототип 1. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ, включающий взятие крови, введение испытуемого вещества и раствора окисленного олеата с последующей регистрацией эритрограмм, о т л ич ающий с я тем, что, с целью повышения точности измерений, испытуемое вещество вводят перитонеально животному и антиоксидантную активность определяют по соотнсшению между двумя стадиями гемолиза эритроцитов .окисленным и неокисленным олеатом.

1097264

Изобретение относится к биологии и медицине и предназначено для определения антиоксидант ной активности веществ.

Известен способ определения антиоксидантной активности химических соединений хемилюминесцентным способом, заключающимся в том, что в окислительной ячейке с термостатируе. мой рубашкой проводят окисление этилбензола при 3/ С в присутствии инициатора — дициклогексилпероксидикарбоната, для усиления квантового выхода хемилюминесценции добавляют

9,10-дибромантрацен в концентрации

5-10 4 М. Выделенные экстракцией 15 смесью хлороформ-;эфир (1: 1) липиды вводят в ячейку, что способствует снижению интенсивности хемилюминесценции. Действующую концентрацию антиоксиданта определяют по сост- 2О ношению площадей под кривой хемилюминесценции в присутствии и в отсутствие ингибитор» $1).

Недостатками способа являются невысокая точность и возможность регистрации антиоксидантной активности только тех препаратов, которые обладают прямым антиоксидантным действием.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ определения антиоксидантной активности веществ на основе олеиновокислых эритрограмм, заключающийся в том„. что в кювету, содержащую взвесь эритро- 35 цитов стандартной концентрации, вводят испытуемое вещество и раствор окисленного олеата, продукты окисления олеата вызывают повреждение мембраны эритроцитов с последующим 4р гемолизом, что регистрируют фотометрически,при наличии антиоксидантной активности интенсивность гемолиза уменьшается, что приводит к увеличению в сравнении с контролем вре- 4 меня 50% гемолиза (2 j.

Недостатком способа является то, что антиоксидантную активность определяют в экспериментах in vitro которую может проявлять не само вещество, а продукты его метаболизма или активация антиоксидантных систем организма.

Цель изобретения — повышение точности измерений.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения антиоксидантной активности веществ, включающему взятие крови, введение испытуемого вещества и раствора скис- 60 ленного олеата с последукщей регистрацией эритрограмм,испытуемое вещество вводят перитонеально животному и антиоксидантную активность определяют по соотношению между двумя 65 стадиями гемолиза зритроцитов — окисленным и неокисленным олеатом., На фиг. 1 представлена эритрограмма, полученная при гемолизе окисленным олеатом натрия на кровь контрольных животных (мжаей), которым перитонеально ввоЯят 0,9Ъ-ный раствор

NaCf; на фиг. 2 — эритрограмма,полученная при гемолизе неокисленным олеатом натрия на кровь мышей, которым перитонеально вводят тот же раствор соли; на фиг. 3 — эритрограмма, получейная при гемолизе окйсленным олеатом натрия на кровь мышей, которым перитонеально вводят феназан натрия.

Пример. Олеат натрия растворяют в изоосмотическом фосфатном буфере рН 7,4 в концентрации 12 мгВ в течение 30 мин при 20 С. Окисление олеата натрия проводят при 90 C пропуская воздух через раствор. В процессе окисления отбирают пробы для определения степени окисления методом эритрограмм.Окисление останавливают при равенстве двух стадий гемолиза — быстрой и медленной.

Подопытному животному перитонеально вводят феназан натрия (натриевая соль-4-окси-3,5-дитретбутил-фенилпропионовой кислоты) из расчета

100 мг/кг живого веса и через 30 мин из хвостовой вены берут кровь для анализа, экспериментально установлено, что оптимальное время проявления препарата в крови 30 мин) . Контрольным животным пернтонеально вводят

0,9%-ный раствор NaC1. Зритрограмму записывают в следующих условиях:

2 мя взвеси,эритроцитов в физиологическом растворе (1600 шт/мм3) сме— шивают с 2 мл раствора окисленного олеата натрия в термостатированной ячейке при 24 С. Гемолиз непрерывно о регистрируют по изменению оптической плотности взвеси эритроцитов при длине волны 630 нм.

Графический материал, отражающий опыты с фе н аз аном и атрия, из о бр аже н в. следуницих координатах: ось абсцисс соответствует времени лизиса в минутах; ocb ординат — процент эритроцитов в опытной кювете. За 1004 принимают содержание эритроцитов, соответствующее значению, устанавливающемуся после смешивания всех компонентов в опытной кювете (процент эрИтроцитов, лизированных в фазе быстрого и медленного гемолиза в сумме) . В условиях эксперимента лизис заканчивается к 3 мин. результатом опыта является двухступенчатая эритрограмма с соотношением между ступенями быстрого (1) и медленного (11) гемолиза: для гемолиза окисленным олеатом натрия эритроцитов контрольных животных, которым перитонеально вводят 0,9%109726 4 ный раствор хлористого натрия, соотнсиаение стадий 1: П=О, 83 (фиг. 1); .для гемолиза неокисленным олеатом натрия эритроцитов контрольных животных, которым перитонеально вводят

0,9%-ный раствор хлористого натрия, соотношение ступеней 1-:П=1,3 (фиг.2); для гемолиза окисленным олеатом натрия эритроцитов животных, которым перитонеально вводят раствор феназина натрия из расчета 100 мг/кг живо- 10

ro веса, соотношение ступеней 1:П=

0,17 (фиг. 3) .

Таким образом, из результатов эксперимента следует, что эритрограмжг, полученные с помощью скис- 15 ленного олеата натрия при введении животному феназана натрия, приобретают вид эритрограммм, полученных с помощью неокисленного олеата натрия при введении животному физиологического раствора, что указывает на защитное действие препарата от продуктов окисления олеата натрия, т.е.о его антиоксидантном эффекте.

Экспериментальные результаты по тестированию феназана натрия способом-прототипом с концентрацией в кювете до 10 г/л (на 2 порядка превышает испытываемую) не выявили антиоксндантной активности.

Для сравнения влияния химических соединений на данные эритрограмма, полученные при действии окисленного олеата натрия на эритроциты мышей непосредственно в процессе лизиса и недоокисленного олеата натрия опос- 35 редственно — после введения препарата животным, проведены эксперименты, кроме феназана натрия (препарат A), с 1-0- (1-силатранил) -2, 3; 4, 5-ди-0-изопропилиден-р-D-фруктопиранозой 40 (препарат В), дийодметилатом ди-P—

-диметиламино-этилового эфира 2, 7-диэтилоктандиловой-1, 8-кислоты (препарат С) и винилоксиэтилами иной солью 2, 4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (препарат D) .

Результаты приведены в табл. 1 и 2.

В табл 1 показаны результаты двух экспериментов. В первом изучают иепосредственно действие препаратов на соотношение процентов эритроцитов, лизированных в результате, быстрого и медленного лизисов при проведении опытов путем смешивания в эксперимен-55 тальной кювете 2 мл суспензии эритроцитов, 1 мл 40 мМ раствора испытываемого вещества и 1 мл 12 мг%-ного раствора недоокисленного олеата натрия, приготовленных на физраство- 60 ре (суспензии эритроцитов и раствора испытываемого вещества) и a натрий-фосфатном буфере с рН 7,4 (для олеата натрия) . Конечная концентрация препаратов 10 мМ. 65

Во втором эксперименте исследуют опосредованное действие изучаемых препаратов путем введения их животным и последующей регистрацией олеиновокислых эритрограмм.

Разработанный способ тестирования химических соединений на антиоксидантную активность позволяет повысить точность измерений и получить возможность определять антиоксидантную активность препаратов не только при прямом действии, но и опосредованно, в частности при действии йх метаболитов.

Представленные данные указывают на отсутствие достоверных изменений соотношений фаз гемолиза при непосредственном действии. Для препаратов В и Д получено значительное ускорение быстрого гемолиза, причем для препарата В все эритроциты лизировали в фазу быстрого лизиса, а для препарата Д вЂ” более 80% эритроцитов, в то время как в контроле только 36%. ПолУченные результаты указывают на возможное альтерирующее действие отмеченных препаратов на эритроциты, но не об их антиоксидантной активности.

При опосредственном действии наблюдается статистически достоверное уменьшение соотношения частей эритроцитов, лизированных при двух стадиях гемолиза — от 0.59+0,04 для препарата В до 0.17+0,04 для препаратов А и Д.Испытанные концентрации для экспериментов с опосредованным действием в 15-30 раз меньше, чем для эксперимента с непосредственным действием. Полученное уменьшение соотношения частей эритроцитов, лизированных в фазах быстрого и медленного гемолиза в экспериментах с опосредованным, действием вплоть до соотношения. наблюдаемого для лизиса неокисленным олеатом (0,12+

+0,02), свидетельствует о защитном действии на эритроциты продуктов метаболизма изучаемых препаратов от окисленного олеата, т.е. об их антиоксидантном действии.

В табл.2 представлены результаты двух экспериментов, полученных при непосредственном и опосредованном действии изучаемых препаратов на время 50%-ного лизиса эритроцитов млаей под влиянием окисленного олеата натрия. Представленные результаты указывают на отсутствие антиоксидантного эффекта изучаемых препаратов при проведении анализа путем использования способа-прототипа. Препараты В и Д в концентрациях 10 мМ оказали альтерирующее воздействие на эритроциты. В то же время при испытанных концентрациях ни один из изучаемых препаратов не выявил достоверного увеличения времени 50%-ного лизиса.

S 1.097264 б

Т аблиц а 1

Непосредственное действие Опосредованное действие

Препарат

Т /Т

6Ыстр Медл

Т /T> Концентрация быстр Медл

Концентрация мй/кг мг/кr мМ/кг мг/кг

Контроль

NaC2

0,56+0,03

О, 96+0, 05

10 3000 0,48+0,04 0,33 100 0,17+0,02 о

О ..35 150 0,59+0,04

10 4330 00

10 6560 0,55т0,03 0,76 500 0,22+0,05+

10 3080 4 15тО 20" 0 33 100 О 17+0 04»

"Достоверное отличие (р/О, 05) .

Т.аблица 2

Опосредованное. действие

Н епосредст венное .цей ствие

Препарат

Концентрация, мИ

OgbtC / M T

ЕО /о 5b Ь

Концентра Тбо, /Т5о о ыт контр ция, мМ

0,1 0,93+0,04 О

1,0 0,95+0,05 0,33

10,0 1,03+0 04

1, 17+0,09 с

1 02+0 03

0,92+0,06 0,35

О, 56+0,09

0,1

1,0

1, 16+0,08

10,0

Сравнение данных табл. 1 и 2 покаэивает, что проведение анализа по Редлагаемому способу дает увеличение точности по сравнению со способом-прототипом и, в частности, позволяет регистрировать антиоксидантную активность метаболитов.

i097264,7

Продолжение табл. 2

Опосредованное. дейст« вие

Препарат

Непосредственное действие

Еонцентра Т " /Т" в,

ЦЯЯ .ЭИ

Конден а ТФеф

5в и 5О»

%%% Ч

0,1 0,98+0,05

0,98+0,03 0,76

1,0

1, 12+0 08

10,0 1,07+0 05 1,05+0,04

0,1

1,0

1, 10 0,08

0,93+0,07 0,33

0,65+0 12+

10,0

Я,7

Teus

3 мйу

Составитель В. Кузьмичев

Редактор М.Товтин Техред T.ôàíòà Корректор С.шекмар

Заказ 4085/3 Тираж 688 Подписное

ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4