Способ получения пероксидазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ , включающий гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента , фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию, .отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, -содержащий NaCl в концентрации 0,490 ,51 М, и аскорбат натрия в концентрации . 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлозе . или диэтиламиноэтилцеллюлозе .

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) 3(5)) С 12 Н 9 08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВЪ (21) 3488294/28-13 (22). 27 ° 08 ° 82 (46) 15.08.84. Бюл. 9 30 (72) Б.Г,Мухамеджанов, Г.Г.Садвакасова, P.М.Кунаева, Г.P.Áàëòàáàåâà и М.A,Añêàðoâà (71) Институт ботаники AH КазССР (53) 577.15 (088 ° 8) (56) 1.Патент Венгрии 9 105727, кл С 07 G 7/022, 1976

2.Патент Венгрии )) 172872, кл ° С 07 0 7/022, 1979. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗЫ, включающий гомогенизацию растительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта. сульфатом аммония и его гель-фильтрацию, отличающийся тем, что, с целью увеличения выхода фермента, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, содержащий МаС1 в концентрации 0,490,51 М, и аскорбат натрия в концентрации 0,029-0,031 М, а после гельфильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбоксиметилцеллюлоэе. или диэтиламиноэтилцеллюлозе.

1108102 сульфатом аммония и его гель-фильт- рацию, в качестве растительной ткани используют листья полыни, для экстракции используют водный раствор, содержащий NaC1 в концентрации 0,490,51 М, и аскорбат натрия в концентрации 0,029-0,031 М, а после .гель- . фильтрации проводят ионообменную хроматографию на карбометилцеллюлозе или диэтиламиноэтилцеллюлозе.

10 С целью увеличения выхода фермента в воду при экстракции добавляют

NaC1 (0,49-0,51 M) для предотвращения окислительного действия фенольных соединений добавляют аскорбат

35 натрия (0,029-0,031 М) . Это позволяет значительно повысить выход целевого продукта.

Пример 1. 70 r листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,5 М ИаС1 и отжимают через ткань. Балластные белки осаждают сульфатом аммония до 30%-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения.

Осадок отделяют центрифугированием, перерастворяют в ацетатном буфере (0,005 М, рН 4,4) и пропускают через колонку с G-,50. Затем проводят очистку на колонке с КМ-целлюлозой. Результаты выделения фермента представлены в таблице.

Выход, Ъ

Активность

Степень очистки

Общий белок, мг

Общий объем, мл

Стадии очистки общая удельная, мкмоль/MHH на 1 мг

Раствор исходный

20,1

4020

200

После

G-50

4,7

94,8

8960

94,5

После

КМ=52

1 50

65,6

3000

5880

1,96

1 пик

2 пик

2590

460

9250

0,28

Пример 2. 70 г полыни гомоге,низируют вдистиллированной воде с

NaCl (0,45 М) . Для осаждения балластных белков проводят высаливание балластных белков сульфатом аммония до 20%-ного насыщения. Осадок отбрасывают, а в надосадочную жидкость 60 добавляют сульфат аммония до 80%-ного насыщения.

Осадок отделяют центрифугированием, перерастворяют в ацетатном буфе ре (0,005 M, pH 4,4) и пропускают

Изобретение относится. к биохимии и может быть использовано для промышленного и лабораторного получения пероксидаэы.

Известны различные способы получения пероксидазы из корней хрена

Cll и С23

Однако они не обеспечивают достаточно высоких выхода и активности фермента в силу длительности и многостадийности процесса выделения.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ получения пероксидазы, включающий гомогениэацию корней хрена, экстракцию фермента водой, фракционирование экстракта сульфатом аммония и его гель-фильтрацию С21.

Однако способ характеризуется недостаточно высоким выходом фермен га (удельная активность 1180

1340 Б/мг белка) .

Целью изобретения является увеличение выхода и активности пероксидазы.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения пероксидазы, включающему гомогенизацию, растительной ткани, экстракцию фермента, фракционирование экстракта через колонку с G-50. Фракции, проявляющие пероксидную активность, очищают на KM-целлюлозе. Общий выход фермента 1,9 мг с активностью

2600 мкмоль/мин на 1 мг фермента.

Пример 3. 45 r полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,55 M NaC1. После удаления балластных белков, осаждаемых при

20%-ном насыщении сульфатом аммония, ;проводят высаливание при 80%-ном на .сыщении. Осадок отделяют центрифуги1108102

Составитель В,Муронец

Редактор T.Êoëá Техред A.A÷ Корректор Д.Мельниченко

Заказ 5838/18 Тираж 522 Подписное

В1ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5 филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 рованием и перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 4,4) . Предварительно обессоленный белок на колонке с G-50 пропускают через колонку с КМ-целлюлозой. Общий выход белка

14,3 мг с активностью 1200 мкмоль/мин на 1 мг фермента.

Пример 4. 1 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,029 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и пропускают через

1 олонку с сефадексом G-50. Получают астично очищенный ферментный препарат с активностью 372 мкмоль/мин на

1 мг белка с общим выходом белка

2,5 мг.

Пример 5. 1 г листьев полыни гомогенизируют в дистиллированной воде. Гомогенат фильтруют и пропус-.. кают через колонку с G-50. Получают ® частично очищенный ферментный препарат с активностью 226 мкмоль/мин на !

1 мг белка с общим выходом белка

2,5 мг.

Пример 6 ° 70 r полыни гомогенизируют в дистиллированной воде с 0,51 М NaC1 и 0,03 М аскорбата натрия. Гомогенат фильтруют и удаляют балластные белки высаливанием сульфатом аммония до 30%-ного насыщения. Супернатант высаливают сульфатом аммония до 80%-ного насыщения. Полученный осадок перерастворяют в 0,005 М ацетатном буфере (рН 7,7) и наносят на колонку с

ДЭАЭ-целлюлозой. Пероксидаэа элюируется с колонки при концентрации

NaC1 0,5 M. Выход белка 15 мг с удельной активностью 1314 мкмоль/мин на 1 мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает получение фермента пероксидаэы с высокими выходом и удельной активностью из доступного и дешевого сырья.