Способ получения конъюгированных антигенов

 

1. СПСЮОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ путем модификации полнциклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином при рН 7-8 в во/хно-диоксановой среде, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию полициклических ароматических углеводородов проводят обработкой надкислотами , а общее массовое соотношение полициклического ароматического углеводорода, надкислоты и альбумина составляет Г:

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„SU„„1113128

А зг,яу А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕЧЙНИЙ И ОТНРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3533381/28-13 (22) 07.01..83 (46) 15.09.84. Бюл. № 34 (72) Л. А, Пирузян, И. Е. Ковалев, О. Ю. Полевая, H. fl. Данилова, С. Л. Шумова и H. Ю. Томилина (7I ) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 5?7.15(a8) (56) 1. Незлин P. С. Биохимия антител. М., «Наука», 1966, с. 37. (54) (5?) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНЪЮГИРОВАННЫХ АНТИГЕНОВ путем модификации полициклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином при рН 7 — 8 в водно-диоксановой среде, отличающийся . тем, что, с целью упрощения процесса, модификацию полициклических ароматических углеводородов проводят обработкой надкислотами, а общее массовое соотношение полициклнческого ароматического углеводорода, надкислоты и альбумина составляет 1:(0,6— — 4): (1 — 3).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве полициклических ароматических углеводородов используют бензпирен или

3-метилхола нтрен.

1113128

Недостатком этого способа получени конъюгированных антигенов является дли тельность и трудоемкость процесса. Реак циоииоспособное производное углеводородов получают в несколько стадий.. Кроме того, в способе необходима очистка промежуточных производных, применение в ходе синтеза большого количества растворителей, концент рированных кислот и токсичных веществ (фосген).

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводород — антигенный носитель), которые могут найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим ароматическим углеводородам, нейтрализация канцерогенного действия углеводородов и для определения их концентрации и локализации в жидкостях и тканях организма.

Известны способы получения конъюгитов белков и низкомолекулярных веществ-гаптенов, в которых два компонента соединены через диазосвязь 1!).

Однако способ характеризуется недостаточно прочной связью при конъюгации полициклических ароматических углеводородов.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к изобретению является способ полу- щб чения конъюгированных антигенов путем модификации полициклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумином прн рН 7—

8 в водно-диоксановой среде при весовом соотношении соответственно (0,1 — 0,35):1.:

В качестве модифицированных производных .полициклических ароматических углеводоро) ов используют их изоцианатные произ-: водные. Модификацию ароматических угле-, Зп водородов проводят следующим образом.

Для введения реакционноспособной группы углеводороды нитруют избытком концентрированной азотной кислоты, полученное нитропроизводное очищают перекристаллизацией из смеси бензол-лигроин н затем восстанавливают водородом или хлоридом олова в концентрированной соляной кислоте до соответствующих аминопроизводных. Аминопроизводные углеводородов очищают экстракцией из аммиачного раствора бензолом и кристаллизацией из лигроина. Далее аминопроизводные растворяют в бензоле и обрабатывают 10 — 16-кратным избытком фосгена в толуоле. После упаривания растворителей получают реационноспособные изоцианатные производные углеводородов. 4>

Очистку полученных конъюгированных анти генов обычно производят повторным переосаждением сульфатом аммония нли ацетоном с последующим диализом.

Целью изобретения является упрощение процесса, Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения конъюгированных антигенов путем модификации полициклических ароматических углеводородов с последующим взаимодействием модифицированных углеводородов с сывороточным альбумнном при рН 7 — 8 в водно-диоксановой среде, модификацию полициклических ароматических углеводородов проводят обра боткой надкислотами, а общее массовое соотношение полициклического ароматического углеводорода, надкислоты и альбумина составляет 1:(0,6 — 4):(1 — 3).

В качестве полициклических ароматичес-. ких углеводородов используют бензпирен или З-метилхолантрен.

Способ осугцествляется следующим образом.

Реакционноспособное производное углеводородов получают в одну стадию их инкубированием с избытком надкислоты в диоксане при 0 — 25 С в течение 24 ч в темноте.

Далее реакционноснособное производное углеводородов без стадии выделения добавляют по каплям к перемешиваемому раствору белка в фосфатном буфере при рН 7 — 8.

Смесь перемешивают 24 ч.при 0 — 25 С. Получеиный конъюгированный антиген отделяют от низкомолекулярных примесей гельфильтрацией на сефадексах. Содержание углеводородов в конъюгатах определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области 30000 — 24000 см сравнением экстинкции эталонных растворов углеводородов с экстинкцией растворов полученных конъюгатов. В зависимости от соотношения реакционноспособного производного углеводорода и белкового носителя, введенных в реакцию, получают конъюгированные антигены, содержащие от 2 до 20 молекул углеводорода на молекулу носителя

В предлагаемом способе по сравнению с известным упрощена технология (проведение реакции в две стадии вместо четырех без очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3 раза) за счет использования другого приема активирования (введения реакционноспособной группы углеводорода для коньюгирования с белком), а также установления режима осуществления процесса. Соотношение реакционноспособного производного углеводорода и белка I:(1 — 3) в реакции конъюгировання выбрано в таких пределах, при которых получают конъюгированный антиген оптимального качества, т. е. содержащий от 2 до 20 моль углеводорода на

1 моль белка. При меньшем количестве углеводорода в конъюгате ухудшаются его антигенные свойства, при замещении большем, чем 20 моль углеводорода на 1 моль белка, 1113! 28 Тираж б87 Подписное .Ужгород, ул. Проектная, 4

ВНИИПИ 3aказ 61?1/7

Филиал ППП «Патент», r. ухудшается растворимость конъюгированного антигена, а также возможны нежелательные побочные явления при иммунизации животных. Выбранный интервал температур позволяет проводить реакцию конъюгирования с достаточной скоростью при стабильности бел ко во го нос и тел я.

Пример 1. Получение конъюгированного антигена бензпирен — - бычий сывороточный альбум ин.

5 мг (2,1.10 М) 3,4-бензпирена раство- 1О ряют в 0,5 мл сухого диоксана, добавляют

7 мг (4,2 10 5 М) м-хлорнадбензойной кис лоты и смесь инкубируют 24 ч при комнатной температуре. Полученный раствор реакционноспособного производного бензпирена по каплям при перемешивании приливают к раствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера, рН 7,4.

Через сутки полученный конъюгированный антиген очищают от низкомолекулярных примесей гель-фильтрацией на сефадексе G-25. g0

Спектрофотометрически определено, что с одной молекулой белка в конъюгированном антигене ковалентно связаны 2 — 3 молекулы бензпирена.

Пример 2; Получение конъюгированного антигена безпи рен — человеческий сывороточный альбумин.

К 5 мг (2,1.10 5 М) 3,4-6ензпирена в

0,5 мл сухого диоксана добавляют IO мг (6,3 10 5 М) м-хлорнадбензойной кислоты, смесь инкубируют в темноте в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к раствору 15 мг человеческого сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера Рн 7,4. Смесь перемешивают в течение суток при комнатной температуре и разделяют на колонке с сефадексом G-25. Полченный конъюгированный антиген бензпиренчеловеческий сывороточный альбумин содержит 5 — 6 моль бензпирена на моль белка.

Пример 8. Получение конъюгированного антигена 3-метилхолантрен — бычий сывороточный альбумин.

5 мг (1,9 10 М) метилхолантрена растворяют в 0,5 мл сухого диоксана, добавляют

3 мг (1,9 ° 10 М) м-хлорнадбензойной кислоты, инкубируют смесь в темноте при комнатной температуре в течение 24 ч. Полученное реакционноспособное производное метил45 холантрена вводят в реакцию с 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера. После очистки гель-фильтрацией на сефадексе G-25 получают конъюгированный антиген метилхолантрен-бычий 50 сывороточный альбумин, в котором с одной люлекулой белка ковалентно связаны 5 молекул метилхолантрена.

Пример 4. Получение конъюгированного антигена 3-метилхолантрен — бычий сыворотсчный альбумин. 55

l5 мг (5,7 10 а М) метилхолантрена в

0,5 мл сухого диоксана инкубируют с !8 мг (11,4 10 М) м-хлорнадбензойной кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к растрору 15 мг фосфатного буфера рп 7,4. После инкубации в течение суток при комнатной температуре получают конъюгированный антиген метилхолантрен — бычий сывороточный альбумин, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 17 молекул метилхолантрена.

Пример 5. Получение конъюгированного антигена 3-метилхолантрен — человеческий сывороточный альбумин.

5 мг (31,9-10 5 М) метилхолантрена в

0,5 мл сухого диоксана инкубируют с 6 мг (3,8 10 М) м-хлорнадбензойной кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к раствору 15 мг человеческого сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера рН 7,4. После инкубации в течение суток при комнатной температуре получают конъюгированный ан-. тиген метилхолантрен-человеческий сывороточный альбумин, содержащий 9 молекул метилхолантрена на моль белка.

Пример б. Получение конъюгированного антигена метилхолантрен-бычий сывороточный альбумин.

5 мг (31,9 10 М) метилхолантрена в

0,5 мл сухого диоксана инкубируют с 20 мг (4,2-10 М) мононадфталевой кислоты в течение суток при комнатной температуре и добавляют по каплям к раствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 5 мл фосфатного буфера рН 7,4. После инкубацйи в течение суток получают конъюгированный антиген метилхолантрен-бычий сывороточный альбумин, содержащий 4 моль метилхолантрена на I моль белка.

Таким образом, в предлагаемом способе реакционноспособное производное углеводородов получают в одну стадию, в то время как в известном в три стадии; исключается целый ряд реагентов и растворителей (концентрированные азотная, соляная, уксусная кислоты, хлорид олова, концентрированный раствор аммиака, бензол, толуол, лигроин), в том числе опасный для жизни реагент— фосген; процесс значительно убыстряется, в предлагаемом способе он требует 3 дня, в то время как в известном 10 дней. Значительно сокращены расход материалов и затраты труда на единицу продукции, за счет чего достигается существенное удешевление и упрощение технологии.

Кроме того, предлагаемый,способ обладает преимуществом получения соединений, состав и .структура которых максимальна приближена к естественным (природным) конъюгированным антигенам.