Способ выделения миелопероксидазы
1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ШЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ из клеток костного мозга человека путем гемолиза эритроцитов солевым раствором, отделения лейкоцитов и экстрагирования фермента с последующей ионообменной хроматографической очисткой и гельфильтрациейд отличаю, щийся тем, что, с целью повышения -выхода и активности фермента и упрощения процесса, кспользуют сырье в криококсервированном виде, для гемолиза эритроцитов используют изотонический раствор , а для экстрагирования фермента - раствор катионного детергента„ хроматографическую очистку осуществляют накатионообкенном сефадексе; содержащем группу -O-CjH, - SO,-. 2.Способ по п. 1, отличаюш и и с я тем, что Е качестЕге катионного детергента используют цетилтриметиламмонийбромид с концентрацией в растворе 1-2%. 3.Способ по пп. 1 и 2, отличающийся тем, что экстрагирование фермента, его очистку и гельфильтрацию проводят в водном растворе CH COONa и NaCl.
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСтИЧ НИИАР
РЕСПУБЛИН
I:
ОПИСАНИЕ КЗОБРЕ7ЕНИЯ н авторскому свидвтвльствч д
Ж 3
ГОСУДАРСТНКННИй КОМИТЕТ жо
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТЙРЬПМЙ (21) 3570880/28-13 (22) 06.01.83 (46) 15.09.84. Бюл. ¹ 34 (72) О.N. Янковский и И.В. Ионахенко (71) Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. А.А. Жданова (53) 577.15.07(088.8) (56) 1. Matheson N.R., Mong Р,S,, Travis V. Isolation and properties
of human пепсгорЬ 1 myelopегоxidase.—
"Biochemistry", 1981, Vol. 20, № 2, р. 325-330.
2, Шафран М.Г. Выделение и некоторые свойства миелопероксидазы костного мозга человека.- Вопросы медицинской химии", 1979, № 2, с. 149-153. (54)(57) 1. СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ из клеток костного мозга человека путем гемолиза эритроцитов солевым раствором, отделения лейкоцитов и экстрагирования фермента с
|gl, С 12 Я 9!08//А 61 К 37 48 последующей ионообменной хроматографической очисткой и гельфильтрацией, отличающийся тем, что, с целью повьпиения .выхода и активности фермента и упрощения процесс †;. ис-пользуют сырье в криоконсерви.=ованном виде, для гемолиза эритроцичов используют изотонический раствор
NH C1, а для экстрагирования фермента — раствор катионного детергента. хроматографическую очистку ocymeствляют на катионоооменном сефадексе. содержащем группу -О-С Н вЂ” $0 — .
6 2
2. Способ по и. 1. о т л и ч а юUI H и с я тем, что =- качест.-:.е катионного,цетергента используют цетнл триметиламмонийбромид с концентрацией в растворе 1-2Х.
3. Способ по пп. 1 и 2. o - л ич а ю шийся тем, что экстрагирование фермента, его очистку и гельфильтрацию проводят в водном растворе СН СООИа и МаС1.
1113 307 тях (Изобретение относится к биохимии, -|астности к способам извлечения ферментов (энзимов), и может быть использовано для получения препаратив ного средства в клинической и экспе- 5 риментальной медицине, а также в фармакологической промьш!лент!Ости.
Известен способ выделения миелопероксидазы из лейкоцитов крови млекопитающих путем экстракции детергентом или раствором с высокой ионнаЯ силой с последующей очисткоЙ113)
Данным способом можно получить значительное количество лишь ксеHo— генного, т.е. выделенного из лейкоци- "» тов крови животных препарата, что
cущс cTf3pHHo ОГpaничив<зет c(1>ppy БГО испо:Iьзо<Зяния Б част|IGcTH» Б л< ч»36 т!ОЙ практике. Для получения приГoitttoA д33я клиническоГО Hctloifbзова- 20 ния миелопероксидазы из лейкОцитО(3 челове!»а требуется »3агстов1»ть 60:ц,— шие количеств»! Ite(>6xn!;,Имой для переливания больньlм и jf îðî 1 О стоящей донорской кров|1. Кроме того, с<эдер- 25
>канне миелопероксидазы в зрелых клеткях миелоид||о|.о ря;,я — гранулоцитах периферич ñ"êîй крови значительно нlгже, чем в мол о.|ых и. 10 I к як 3 TO0 )яда, 13 оcnápl!ИОСТ|1 и промие.inò,, и >О
33(11!6031((. 6(lиз ок к т! p(,I ifÿ i я» мОму по технической су!яностft и цостигае— мому резул|,Tary (пос(>б выдpления миелоперокcifjfa3ы 1:3 клс-Toк костного
М О 3 Г Я Ч С Л О Р (. К Я К О (! H O i! O 3!" О Б О И взвеси 11» тем гемо.|и:|я >ритрлцитов гllt!отан !ческим раствором — О, 237 — н!ым рас твором Хс(С1 (>тjii
4(3 выделения .!изосомяльной фракции из лс йкоцитов диффер»!It;ft;l.,ы|ым ItpHTplf— фугиро||янием, !кстря! Нр(:вя!и!я I!:3 нее
$(pit(!IT(1 (>< .— it!<3 (ТНОТ>ом N 30 1 Б ф(»сфатно(! буфер((р33 7, О) c:I0cilP-—
3»
ДУ к>1111 м,|I|a. 111 30>! 31< (1 I><|K (ci О Ти(. l < 01! миелоперокси;Таз t ftoaoo6Mp!tffoIA хро
Mc3 Tot päôtf A НЯ Kojfo !KP <" .13 AI,-(;(ô Iдексом Л- >О (уря;. .нове. пенной О, 1 3( фосфятным буфером, р)3 7,0) и .:.! Ko
- 3O лонке с К>1-!Теллксло Зой (уравновешенной
О, 05 33 фосфатным бу(!>еp(> f, рН ",0)l и
Г P J I b p I f JI ь т р a I Т и е и (О 6 ы ч t l o н <ч к 0 t o I: K - с сефядексом С вЂ” 100, ур(|вн(1»с ш(- н«oй
О, 1 31 фос >;3TH! и| б фером, р33 7,0, с О, 11 31 33!01
IlO(-,.;1,!fit!!fait .,|; Як 1(3пlе 1 ;Ka 1 : ЗiÇPс THOI Гп >Г (1 ii (;|ГТ::в" е»|Я FÇ Я63(. 1
Недоста.ками известного способа являк!тся невысокие выход и активность выделяемого фермента, а также многостядийность способа. В частности, как видно из таблицы, из 2,0 10 клеток удается выделить из экстракта
4,3 мг миелопероксидазы (16K).
Известный способ выделения миело— пероксидазы предусматривает испсльзование Б качестве исходного сырья взвесь из свежезаготовленного кост| ого мозга человека, что обусловливает необходимость немедленного начала процесса выделения миелопероксила Зы, так как хранение костно— мозговой взвеси при положительных
fpмпературях приводит к гибели лейконитов и разрушению со,пержашей,:я
Б них миелопероксидазы (замораживаНИЕ КOC.THO OT
cутстБии криоконсервантов исключается из †дсструкции клеток), а ..-акже по>! «(!ент|е лип|в небольших количеств
itp et! apa Ta из-з я о:-сутствия в озм(>ж—
11(>с т!! Одновременной заготовки исходного сырья — костного мозга от 6ольшо о числа доноров или трупов скоропостижно умерш !х людей. Применение этого снос.оба для выделения мие.|оп",pntcc flea!I*.,i:из кл(ток криоконсервир(>вянногo кo;.òiiîco мозга невозможно .3 поскольку Б присутствии криокон:ер
Бантов 1|е удяетcH ocуп(ествить ф,>aK ци(нпрс||ание клеток и солевую экст—
P (»(f;,t Ii(>.
Наряду с этим способ нс Гара!!Тиру т,(3 c T
>|из и-a opt;TpoIIHToH (сопровождаюшего— ся рязрушс!!Нем час-,Н лейкоцитов) и нри выделении лизосомальной фракции Б ходе дифференциального центрифугирования (потеря фермс.нта до 707.), Указанный с!!особ выделения мие Топс poKcf!, (a:зь| мнОГО стадийный (б эта Ho!3) I3«J1evae T ItaP:-fH c s TaHow tfoJty«(3; i!!3 с убклеточ ной (лизосомальной) (пря!»ции длительный диализ -.о— левого экстракта (20 ч), малоэффективный этап очистки миелопероксидаЗы из днajtffaa Та ионообменной хроматографией на ДЕЛЕ-Сефадексе А-50 (oчистка 3 1,2 разя), ионообмен !ую хромотогряфию на КМ-целлюлозе и Гельфильтрацию на Сеф(3дакс.е С-100. Кроме тоге, полученный препа.>ат миелопероксидязы характеризуется низ1113407 4 4О Осуществление в соответствии с предлагаемым способом гемализа эритрокой удельной активностью около 1800 ед., Mr белка, что является следствием воздействия неблагоприятных факторов (например, пратеолитических ферментов) в результате дли5 тельного ведения процесса. Цель изобретения — повышение выхода и активности миелопераксидазы, а также упрощение процесса выделения. Поставленная цель достигается fO тем, что согласно способу вьделения миелопероксидазы из клеток костного мозга человека путем гемолиза эритроцитав солевым раствором, отделения лейкоцитов и экстрагиравания фермен- 15 та с последующей ионообменной хроматографической очисткой и гельфильтрацией, используют сырье в криаконсервираваннам виде, для гемализа эритрацитов используют изотани- 2О ческий раствор NH C1, а для экстрагирования фермента — раствор катионного детергента (абычно цетилтриметил— амманийбрамид с концентрацией в растворе 1-2%), храматаграфическую ачист-25 Kó осуществляют на катионообменном сефадаксе, содержащем группу— -О-С,Н вЂ” SO, — . Экстрагирование фермента, его очистку и гельфильтрацию проводят gg в водном растворе СН,COONa и NaC1. Использование в качестве источника получения миелапероксидазы криоконсервированнага костного мозга человека обеспечивает значигельное расширение сырьевой базы для получения фермента, так как криаконсервирование костного мозга при ультранизких температурах (-194 С, жидкий азот) позволяет избежать деструкции клеток и создать долгосрочно хранящийся запас марфо-функционально полноценных миелокариоцитов, т.е. накопить исходное сырье в неограниченном количестве. Упрощение способа получения миелопераксидазы из лейкоцитов человека благодаря присутствию в костнамозговой суспензии экстрацеллюлярных криакансервантав, близких к мембранным структурам клеток способст,вует удалению балластного мембранного материала и упрощает последующую очистку миелопераксидазы, чта в дальнейшем сказывается на сохранении активности фермента. цитов в суспензии клеток костного мозга изотоническим раствором ИНьС1 обеспечивает более щадящие условия для клеток миелоидного ряда, не .-вызывая в отличие от гипоточического раствора NaC1 значительного лизиса лейкоцитов, в особенности их незрелых форм, содержащих повышенные количества миелопероксидазы, и, следовательно потери фермента уже на первых этапах его вьделения. Для реализации предлагаемого способа, кроме цетилтриметиламмонийбромида, могут быть использованы и другие ти ы катионовьтх детергентав, поскольку в них заключены аналогичные свойства: дезинтеграция мембранного материала, осаждение в составе мицелл мембран и отрицательно заряженных молекул (белков, нуклеиновых кислот, гликозаминогликанов), а также преимущественная солюбилизация катионовых белков путем вытеснения их катионовым детергентом из комплексов с отрицательно заряженным материалом. Детергент в отличие ат применяемого в известном способе салеваго экстрагента позволяет вести экстракцию миелопераксидазы непосредственно из лейкоцитов (миелокариацитов), а не из предварительно вьделенной из них субклеточной (лизосомальной) фракции. Это обеспечивает значительное упрощение процесса вьделения миелопероксидазы па сравнению с известным способом, так как позволяет исключить из процесса два этапа: дифференциальное центрифугиравание, необходимое для выделения лизасамальнойфракции и многочасовой диализ экстракта перед ианаабменной хроматографией, тем самым влияя на выход и активность фермента. Наряду с этим цетилтриметиламманийбрамид позволяет осуществлять экстракцию в присутствии криакансервантав, исключающих солевую экстракцию вследствие образования желеобразного несуспендируемого осадка. В качестве сарбента при храматографическай очистке используют $Р-Сефадекса С-50 из-за наличия у него как наиболее сильной, так и наиболее экспанированнай (длинной) связывающей группировки -О-С,Н вЂ” SO, â€, что позволяет вести очистку миелапероксидазы при тех же условиях (рН 6,0), -,то :.- экстракцию ферме»та, а следо-- .Ят ль .с, вс.с процедуру на всех.-;тапях вы! IелcHия м:ioлoп".=рoкcидазL! "=,, и I.II.I p а aс т R с р ом (СН СО(1 N a : ri a С 1 ..", О) ., -Iòî существе!Hc .)проп1ает 1рсцесс, а также способствует сокращен»;с числа стадий и сохране»и)0 актив|ости фермента. Пр".äëàãàåìûé способ позволяет ;ократить число стяГий прсцссса с выделением ферме»та в большем коли— честве (14 16 6 мг) и с большей активностью (500000-600000 ед/мг белка),. Общая продолжитель»ocть процесса 28 )2 р и Ir e р Кп" тo i:-,:;с =--!= icнты,:;-.:!! ороженнсг0 криоко»ссрвирова»»огo ге»изации клеток ис пользу 0! г генизатор типа Даун< а {: 1< к),о Помоге»ат перемешивают 1!а шут аппарате в течение 12-14 ч, и фугируют 60 ми» при 5000 с ., и дочную жидкость (красно-бурый содержащий 5-7Ж пероксилязпой ОМО-стекло),л,п т< чт :„.ентриia;In c aрас.твор„ актив зс Образом„ Осадок ности, определяемой, глав» ям примесью гемоглобина) уда).»10. гсмоге»изируют в 1-27. — »ом рас цетилтриметиляммо»ийбромила ( ленном На 0,1 М СН СООКЯ в О, и цснтрифугrrplют IlpH ) 000 » т 60 мин, Эту процедуру (гомor;: с центрифугпрсва»и м) повторя Т!3 О Р Е. при готовв 1 М NaC1) о ечение низация ;01 u O т в|в ре paза, после чего < с.адок удаляют, костного мозга человека оса)кдают цептрифугированием при 600 с) в тече- 2О »:-1е 15 мин. Надосадочную жидкость удаляют, а осадок клето..< обрабатыва ст О, 838 — ным водным pac I!o!)Oil INHf С1 (при соотношении о: ъе Ioa раствор — осадок 1Ñ:i) Миелокариоциты осаждают при 600 в течение 5 мин :,,общее зремя экспсзигп,и клеток в pacòÂopo КН 40 не ДО 1ж»<) препьсзат) т! 5 мни, ": с):.у че» ныи,»i« то -:.»<,!i F a!!0!< — г. дваждь1 отмывают О, 85,, -:пя; . ":, «.r; — зг) торным це»трисругирсва»ие -. I.p. 00 4 тс. ° »- с 15 мип fr;I. о. -< с-I: к). Жид кость удаляют. Отмытый осадок белых i0 клеток 2,0х10 клеток) гсмоге:;из»в руют в 1 †21 †ом растворе и<::-илтриметиламмонийбромида (пригото.ленном »а 0>1 М СН СООКЯ в 0.,1 М КЯСl) при сост»ос)е»ии oбь«I!oa 1: 1 . П. i;! 1 »ЯДОсадсчьые жидкОсти (зеленого цве та) объеди»я ст и центрифугируют при 100000 60 мин. Полученный зеленый растБОр,экс Г1)акт) »анОсят На кОло»ну (2,5х8 см), заполненную БР-Се— фадексом С-ОО и уравновешенную 0,1 М СН„СО01<1а в 0,,1 . 1 NaC1. Адсорбированн.-зй па колонке:;атериял (темно-зеле»Огс цвета) промываст 0......1 1 1 СН,COONa в 0,2 М МЯС1, Об<нем промывной жидкости составляет 3- - объема колонки <выход балластного материала с коло»ки регистрируют спектрофотометрически при 1 280 и 230 нм). Адсорбирсванную на колонке миелоперскс H;Iaэ ", с 1има!ст пас; Вором 0, 1 С .l.CÑ0NЯ в 0,.28 М КЯГ1, Выход ферм«HT колонки регистрируют спе: рсфотсмст1)ически при 430 Н . Миелопе. роксидазу после ио»ообменной хрома-тографии подвергают дальнейшей очистI е:i-фильтрацией на колонке . 2, 5х60 см), за -o:!Irc»»oé Сефадексом "--100 - уравновешенной 0,1 М СН,C00Na в 0,1 N NaC1. Фермент элюируют через ,<Опс»ку этим же раствором со ско-, сстыс 25 — 30 мл/ .. .10 .. тrr,"èé»a» характеристика предi.aгaFмОго способе пс отдельным ст;!— .-,Иям с»елена в -.:a-áë. 2, <С «р м < н г 1 т и В» ) я я к т и в и о с т ь м и е I o— и< роксидавы, а -.-Якже количество бе.)ка olip«I
i:<)м) способу. Как вид»с и ) табл. 2, предлага»вЂ” мым способом из l, ОК10 клеток уда< тся в. :пелить около 1 4-16, 6 мг очищенп»01 О коне- f!OI о продукта, что в раза прсв II!IB«T кОличествс мие ioii< роксидазы, получаемой известным способом. Вь<деленный препарат миело,-г<рсксидазы Очищен в 25 раз, обла,III«I y;zeльной активностью 500000600000 едlмг белка (т.е. фермент в 10 раз бол«. активен, чем выделен.»яй из1зест»ьм с»oco<)o») и степенью чистоты (от»сшение оптической плот»Ости пои длине волны Д 430 нм к оптической плотности при 280 нм, Е,1.0 Е „ — тандартный критерий чистоты миелоперсксидаз) равной 0,81 — 0,83. Выход фермента после конечного эгапа >Hf.!< тки составляет 30- 1-4Е. 1113407 Таблица 1 Результаты выделения фермента известным способом Количество белка, мг Этапы очистки Степень очистки Степень чистоты Гомогенат лизосом 696,0 Экстракт 160,2 Диализ 111,6 100 8,3 9,0 ДЕАЕ-Сефадекс А-50 79,2 0,20-0,34 10,0 3583,3 КИ-целлюлоза О, 50-0, 60 48, 4 17578,3 10,0 Сефадекс С-100 18309,0 4,3 50,5 0,76 Табл ица 2 Выход, X Степень очистки Этапы очистки Степень чистоты Удельная Количество белка, мг активность единицы на 1 мг белка ЕФЗа 28о Для iX-ного экстракта 100 0,1 21000 22000000 1050 Экстракт 0,58 15 0,81 25 34,4 11320000 324000 14,0 7500000 535000 Для 2Х-ного экстракта 1422 34120000 43,2 14606000 100 0,1 338000 Экстракт SP-Сефадекс С-50 0,056 14 Сефадекс G-100 16,6 10160000 612000 0,83 ЗНИИПИ Заказ 6529/21 Тираж 521 По писнпе Я Филиал НПП "Патейт, г.ужгород, ул.Проектная, 4 SP-Сефадекс С-50 Сефадекс С-100 Удельная активность, единицы на 1 мг белка 362,0 3033,7 3279,5 Суммарная активность, единицы активности Выход,X