Штамм @ @ а-60-продуцент биологически активного комплекса липидов и способ получения биологически активного комплекса липидов

 

1. Штамм Astasia longa А-60 , (коллекдая Московского Государственного Университета им. В.М.Ломоносова)продуцент биологически активного комплекса липидотз. 2. Способ получения биологически активного комплекса липидов, включакщий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источникуглерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование , экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа - метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм простейшего Аз- tasia longa № А-60, аэрацию проводят при режиме 2,0-2,5 объема возсл духа в 1 мин на 1 л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 оборотах в 1 мин.

(19) (11) СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВ,Ф

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2 1) 3403002 /28- 1. 3 . (22) 05.01.82 (46) 15.12.84. Бюл. № 46 (72) Н.Н.Сухарева, Н.С.Егоров, В.M.Óðèíþê и Л.C.Óäàëoâà (71) МГУ им. M.Â.Ëoìoíoñoâa (53) 615. 34 (088 ° 8) (56) 1. Сухарева Н.Н. и др. Состав и антиокислительная активность липидов А.longa. Èçâåñòèÿ АН СССР", Сер. биол.,1973, № 3, с. 334-343. (54) ШТАММ ASTASIA LONGA А-60 — ПРОДУЦЕНТ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО KOM—

ПЛЕКСА ЛИПИДОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНОГО КОМПЛЕКСА ЛИПИДОВ ° (57) 1. Штамм Astasia longa А-60, (коллекция Московского Государственного Университета им. В.М.Ломоносова)продуцент биологически активного комплекса липидов.

see A 61 К 37 22 А 61 К 35/68

2. Способ получения биологичес- ки активного комплекса липидов, включающий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источник углерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа — метанола

2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода и активности целевого продукта, в качестве продуцента используют штамм простейшего Astasia longa ¹ А-60, аэрацию проводят при режиме 2,0-2,5 объема воздуха в 1 мин на 1 л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 оборотах в 1 мин.

11289

50 пидов.

Кроме того, согласно способу получения биологически активного комплекса липидов, включающему культи- 40 вирование посевного материала при . аэрации на среде, содержащей источник углерода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование,экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа-метанола 2:1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание, в качестве продуцента используют штамм простейшего Astasia

longa У А-60, аэрацию. проводят при режиме 2,0-2,5 объема воздуха в 1мин на I л среды, при этом посевной материал выращивают на круговой качалке при 220-250 об/мин.

=55

Полученный штамм Astasia longa ЙА-60 имеет следующую морфологическую и физиологическую характеристики: Astasia

Изобретение относится к микробиологическому производству биологически активных веществ — липидов, используемых в медицине, ветеринарии и парфюмерии. 5

Известно использование в качестве источника липидов смеси различных субстратов, включающей бактерии различных видов и дрожжеподобные организмы Я .

Известен также способ получения биологически активного комплекса липидов, включающий культивирование посевного материала при аэрации на среде, содержащей источник угле- 15 рода, минеральные соли, витамины и воду, сепарирование, экстракцию полученной биомассы смесью хлороформа- метанола 2: 1, очистку выделенного экстракта промывкой дистиллированной водой и последующее высушивание (11

Ф

Однако использование известной смешанной культуры и способа получения из нее биологически активного комплекса липидов не обеспечивают р5 достаточный выход и активность целевого продукта.

Цель изобретения — повышение выхода и активности целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что используют штамм Astasia longa

А-60 (коллекция Московского Государственного Университета им. М.В.Ломоносова) в качестве продуцента био35 логически активного комплекса ли"

55 2

longa имеет длину клетки 30-40 мк и ширину 6-10 мк.

Цитоплазма заполнена парамилоном, который скрывает внутриклеточные структуры. Astasia 1onga — свободноживущий хегутиконосец, подцарство

Protozoa, класс Flagella ta порядок

Englenomonada. Размножается бесполым путем (бинарное деление). Морфологическая характеристика: одноклеточный организм, имеющий удлиненную, почти цилиндрическую форму, задний конец которогî cнабжен сосковидным отростком. Снаружи клетка покрыта оболочкой (пелликулой). Передний конец снабжен жгутом. Жгут является основным органом передвижения флагеллят.

Аз аз а longa характерно присутствие хорошо оформленного ядра. Ядро имеет сферическую форму диаметром

4 мк. На тонких срезах Astasia longa обнаружены рибосомы. А.longa имеет хорошо развитую цитоплазматическую сеть. Имеет комплекс Гольджи, состоящий из параллельных пластинок.

Физиологическая характеристика: по способу питания сапрофит, хемогетеротроф.

Отношение к углеводам: не использу.ет глюкозу и другие углеводы.

Отношение к спиртам: использует э.тиловый спирт как источник углерода и энергии.

Отношение к органическим кислотам: использует пропионовую, масляную, валериановую, капроновую, пировиноградную кислоты, как источник углерода и энергии. Оптимальный источник углерода — этанол. Отношение к органическим веществам: не использует аминокислоты. Оптимальным источником азота являются аммонийные соли.

Способ поясняется примерами.

Пример 1. Для выращивания посевного материала готовят среду следующего состава, вес.7: этиловый спирт, ректификат 1, 19; КН РО 0,043 (ЙН 4) НРО4. 0,062; Йа С6Н50 5Й О

0,043; М 04 0,0008;CaC1. 2 0,001; микроэлементы Fe<(904 ) ч 9Н О 0,0001;

Сц О 0,0001 CoC0 6Н О 0,0001; 04у 7Н О 0,00002; Йà, Мо042Н О 0,00001; витамин В1 0,002; витамий В„ 0,.00001, дистиллированная вода — остальное, начальное значение рН 6,8.

3 11289

Среду разливают в качалочные колбы по 250 мп и стерилизуют при 1 атм 30 мин. Перед засевом среды добавляют необходимые количества этилового спирта и витаминов. Колбы засевают культурой А.longa А-60 в количестве

10Х от исходного объема среды при накоплении клеток 5 10 в одном мп.

Колбы помещают на качалку с числом оборотов 220 об./мин и встряхивают

6 сут . По окончании процесса колбы снимают, отбирают пробы. В пробах определяют число клеток и содержание липидов в них. Число клеток составляет 10" 10 в одном мл среды;

6 количество липидов 8Х веса сухих клеток.

Для проведения выращивания А.longa в ферментерах в объеме 60 л готовят среду следующего состава,вес.Х: этиловый спирт гидролизный 1, 19, KHg P04 О, 043, . (М Н1 )2 НР 04 О, 062

Na qCg Н5 075Н20 О, 043; М фО4 О, 0008, Вита и В 4 0,0002 Вита н В120,0001 водопроводная вода остальное, начальное значение рН 6,8.

Среду стерилизуют при 1 атм 1 ч.

Перед посевом добавляют спирт этиловый гидролизнь1й и витамины. Фермен- тер засевают культурой продуцента в количестве 5Х от исходного объема при накоплении клеток 10 ° 10 в одном мп среды. Устанавливают режим аэриро-. вания 2,0 объема воздуха на 1 объем среды в 1 мин. По истечении 6 суток

35 отбирают пробы, в которых определяют число клеток и количествО липидов.

Число клеток составляет 12 106 в од-. ном мл среды. Количество липидов 12Х веса сухих клеток. Клетки сепарируют, О а из полученной сырой биомассы. количество которой составляет 60 г на один литр среды, выделяют липиды.

Для этого 200 г,биомассы переносят в стеклянную колбу, добавляют экст- 45 ракционный раствор, состоящий из смеси хлороформа и метанола в соот- ношении 2:1, в количестве 2 л(на 1 г биомассы необходимо 10 мп смеси).

Полученную смесь ставят на качалку 50 на 10 ч. Экстракцию проводят при комнатной температуре и постоянном встряхивании. Лизированные клетки отфильтровывают. К полученному экстракту добавляют 1/5 объема 0,74Х-ного вод- 55 ного раствора КС8. Смесь ставят на качалку на 2-5 мин для встряхивания.

Переносят в химический стакан и зали.—

55 4 вают дистиллированной водой. После расслоения экстракта на две фазы: верхнюю — водно-метанольную, нижнюю хлороформенную стакан помещают на дно большего по объему сосуда, также заполненного дистиллированной водой для удаления нелипиднь" водорастворимых примесей, Сосуд оставляют на холоду,в течение 12 ч. Затем верхнюю фазу из химического стакана осторожно удаляют сифоном. Пограничный слой, состоящий из липопротеидов, растворяют метанолом. Метанол добавляют небольшими порциями по 5-10 мл до полного растворения белого осадка липопротеидов. Экстракт высушивают над сернокислым натрием 24 ч и отфильтровывают. Органический растворитель отгоняют на роторном испарителе в вакууме при 10-20 мм рт.ст. и температуре 40-45 С. Остаток в колбе предо ставляет собой общую липидную фракцию простейшего А.longa.

Целевой продукт имеет следующий состав, Х: фосфолипиды 38,5; стерины .

6,2," моноглицериды 2, диглицериды

6; свободные жирные кислоты 7, триглицериды 34,5; эфиры стеринов 8.

Пример 2. Для приготовления посевного материала готовят среду, как это указано в примере.-1.

Колбы засевают культурой А.longa

A-6О, помещают на круговую качалку с числом оборотов 250 и встряхивают

6 сут. Отбирают пробы, определяют число клеток в одном мп среды и количество липи ов. Число клеток составляет 12 10 в одном мл среды, количество липидов 10Х веса сухих клеток.

Для проведения выращивания А."longa А-60 готовят среду следукщего состава, вес.Х: этиловый спирт гидролизный 1,20, КН Р04 0,046;(МН4) НР04

0,00084, витамин В1 0,00026, витамин

В< 0,000014; водопроводная вода остальное, начальное значение рН 6,8.

Далее проводят все операции, как это указано в примере 1. Устанавлива; ют режим аэрации 2,5 объема воздуха на один объем среды в.минуту. По истечении 6 сут отбирают пробы, в которых определяют число клеток и количество липидов. Число клеток составляет 14, 10 в одном мл среды, количество липидов — 14 веса сухих клеток. Клетки сепарируют, из сырой

1128955, Составитель В.Брусиловская

Редактор Н.Горват Техред A.Áабинец Корректор И.Муска

Заказ 9269/6 Тираж 687 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открыгий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Фипиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 биомассы 66 г, выделяют липиды, как это указано в примере 1. Целевой продукт имеет следующие характеристики: липидов 13Х веса сухих клеток.

Далее клетки сепарируют и выделяют липиды,как в -примере 1.

Предлагаемый штамм и способ получения из него биологически активного комплекса липидов позволяет получить целевой продукт повышенным со6 держанием активных компонентов — полиеновых жирных кислот (больше в

1,5 раза), фосфолипидов - в 2 раза больше, снизить продолжительность

5 культивирования со 168-193 ч до 144, заменить пищевое сырье,(спирт ректификат) на непищевое (спирт гидролизный), снизить себестоимость

1 кг целевого продукта в 2,0-2,5 раза по сравнению с прототипом.