Способ получения арахидоновой кислоты

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТЫ, включаюпшй обработку липидов водным раствором щелочиj йодкисление , экстракцию целевого продукTfa органическим растворителем,охлаждение полученного экстракта, последующую его хроматографию на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и обработку щелочью, отличающийся тем, что, с целью повышений чистоты и выхода целевого продукта, после экстрагирования липидов жгутикового простейшего Astasia fonga смесью хлороформ метан .ол в соотношении 2:1, обработку липидовводным раствором щелочи проводят в этиловом .спирте, экстракцию целевого продукта проводят хлоро& формом, растворитель удаляют, обра (Л зовавшийся остаток растворяют в ацетоне , прибавляют к мочевине и проводят хроматографию на колонке при соотношении смеси высших жирных кислот § и адсорбента

ИЮ 01) СООЗ СОВЕТСКИХ

СОЦ 4АЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТБУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3630035/28-13 (22 ). 01 . 08. 83 (46) 07.01.85. Бюл. Р 1 (72) Л.В.Казанская, Н.Н.Сухарева, Т.В.Максимова, Л.С.Удалова, В.М.Уринюк, А.И.Тенцова и Н.С.Егоров (71) 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им. И.М.Сеченова и Москбвский ордена Ленина, ордена Трудового Красного Знамени и ордена Октябрьской Революции госу-дарственный университет им. М.В.Ломоносова (53) 615.45(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

N 463450, кл.. А 61 К 31/075, 1975.

2. Авторское свидетельство СССР

9 643496, кл. С 07 С 57/03, 1979. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРАХИДОНО- .

ВОИ КИСЛОТЫ, включающий обработку

4151) А 61 К 31/20// А 61 К 35/68 липидов водным раствором щелочи, подкисление, экстракцию целевого продукт а органическим растворителем, охлаждение полученного экстракта, после,дующую его хроматографию на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом серебра, и обработку щелочью, о т л и ч а ю щ и " e я тем, что, с целью повышения чистоты и выхода целевого продукта, после экстрагирования липидов жгутикового простейшего Astasia 3onga смесью хлороформ— метанол в соотношении 2:f, обработку липидов водным- раствором щелочи проводят в этиловом спирте, экстракцию целевого продукта проводят хлоро-

9 формом, растворитель удаляют, образовавшийся остаток растворяют в ацетоне, прибавляют к мочевине и проводят хроматографию на колонке при соотношении смеси высших жирных кислот. и адсорбента (1:120)-(1:150).

1132947

Изобретение относится к фармацевтической и медицинской промышленности и касается способа получения био- логически активного средства.

Известен способ получения арахидоновой кислоты из липидов поджелудочкой железы экстракцией изопропиловым спиртом, омылением, подкислением, последующей экстракцией хлороформом и его отгонкой многоступенчатой низкотемпературной кристаллизацией, кристаллизацией с мочевиной в метано-. ле, отгонкой метанола и хроматографированием в тонком слое силикагеля (1) .

Недостатками способа являются неэкономичность из-за дефицита природного сырья липидов, нетехнологичность (использование хроматографии в тонком слое), усложненность способа, невысокий выход и невысокое качество целевого продукта {из 800 г липидов получают 1,45-1,55 г .арахидоновой кислоты с чистотой 90-95%).

Известен также способ получения арахидоновой кислоты иэ липидов надпочечников крупного рогатого скота, в котором липиды омыпяют, подвергают низкотемпературной кристаллизации, этерифицируют и вновь омыпяют. Полученную после омыления смесь высших жирных кислот далее подвергают крисо таллизации при температуре 0 " -5 С, 20

25 из жидкой фазы извлекают неомыляемую

45 часть липидов экстракцией петролейным эфиром, оставшуюся жидкую фазу подкисляют минеральной кислотой, из полученной реакционной массы экстрагируют жирные кислоты петролейным эфиром, экстракт подвергают кристаллизации при t -28 — -30 С, а затем при с -75 - -78 С, петролейный эфир о

1 отгоняют, полученную смесь кислот подвергают кристаллизации в ацетоне при а -77 — -78 С с последующей его отгонкой, полученный при этом концентрат арахидоновой кислоты этерифицируют метиловым спиртом и очищают хроматографией на силикагеле, импрегнированном AgNO в колонке с использованием в качестве элюэнта гексана или диэтилового эфира, причем последний берут в количестве 5-100% от веса гексана. Из полученного концент55 рата метиловых эфиров. выделяют арах ндоновую кислоту путем испарения элюэнта с последующим щелочным гидролизом, экстракцией петролейным эфиром, подкислением полученной реакционной смеси минеральной кислотой и экстракцией арахидоновой кислоты петролейным эфиром (2) .

Недостатками известного способа являются усложненность процесса, неэкономичность вследствие дефицита природного сырья, невысокий выход и недостаточно высокая чистота целевого продукта (иэ 250 г липидов надпочечников получают 5-6 г арахидоно- . вой кислоты с чистотой 95-97%).

Целью изобретения является повышение выхода и чистоты целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения арахидоновой кислоты, включающему обработку липидов водным раствором ,щелочи, подкисление, экстракцию целевого продукта органическим растворителем, охлаждение полученного экстракта, последующую его хроматографию на колонке с силикагелей, импрегнированным нитратом серебра и обработку щелочью, после экстрагирования липидов жгутикового простейшего Astasia Conga смесью хлороформ-метанол в соотношении 2:1, обработку липидов водным раствором щелочи проводят в этиловом спирте, экстракцию целевого продукта проводят хлороформом, растворитель удаляют, образовавшийся остаток растворяют в ацетоне, прибавляют к мочевине и проводят хроматографию на колонке нри соотношении смеси высших жирных кислот и адсорбента (1:!20)-(1:150).

П р и и е р 1. 8,0 r липидов жгутикового простейшего Astasia tonga экстрагируют смесью хлороформ:метанол 2:1, подвергают щелочному гидролиэу в водно-этиловом (1:1) растворе, исходя иэ расчета 0,25 г Na0H на 1 г липидов ° Реакцию проводят 3 ч с об ратным холодильником при t бани 5060 С в токе азота. (В дальнейшем все операции проводят в токе азота) .

Этиловый спирт упаривают, водный раствор подкисляют 10%-.ной серной кислотой до рН 3,5, осадок отфильтровывают, вещество извлекают хлороформом (25 мл х3). Органические экстракты объединяют, промывают равным количеством воды, сушат над

Йа2 БО, и растворитель удаляют в вакууме.

° °

Получают смесь жирных кислот 4,2 r с содержанием арахидоновой кисло3 1132 ты 18,3 . Жирные кислоты анализируют методом ГЖХ на хроматографе VarianNod 3700 (USA) . Условия разделения: стационарная фаза — 10 -ный цианпропильный метилсиликон Р-233; пламенно-ионизационный детектор, инертный носитель — хромосорб А 100200 меш; газноситель — гелий: температуру колонки программируют 150220 С. Эту смесь растворяют в 30 мл 10 ацетона, охлаждают до 0 С и нереме- о шивают 1 ч, выпавший осадок отделяют. Разделение повторяют при t -20 С. о

Остаток смеси высших ненасьпценных кислот (2,8 г с содержанием арахидоновой кислоты 38Х растворяют в ацетоне и прибавляют при перемешивании к теплому раствору мочевины в. ацетоне (11,5 г в 50 мл ацетона) о и оставляют на ночь при t --20 С.

Выпавший осадок отделяют, фильтрат подкисляют 10 НС(до рН, 3,5 и перемешивают в токе азота 30 мин при t +40 C. Реакционную массу охлаждают, поЖненасьпценные жирные кисло- 25 ты извлекают хлороформом (15 мг х 3), органические экстракты объединяют, промывают 2 раза водой, сушат над

MgS04 и растворитель упаривают в вакууме .

Остаток смеси полиненасыщенных жирных кислот (0,9 г с содержанием арахидоновой кислоты 6? ) растворяют в 10 мл безводного метилового спирта, насыщенного хлористым водородом и перемешивают 1 z при < +65оС После 5 охлаждения смеси метанол упаривают, остаток промывают водой, затем 20Хным раствором бикарбоната натрия,. жирные кислоты экстрагирувт хлороформом (25 мл х 3), экстракты сушат и

40 растворитель удаляют в вакууме.

Получают 0,84 г смеси метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот, которые подвергают хроматографии на колонке с силикагелем, импре45 гированным AgNOS.

Адсорбент готовят следующим образом.

К нагретому до 80 С раствору AgNO 50 в дистиллированной воде, прибавляют силикагель марки 100/250 меш.(соотношение силикагеля и AgN0 2:1), интенсивно перемешивают 15 мин,.фильтруют и массу активируют 12 ч при 55

1200С.

Затем адсорбент охлаждают, добавляют к нему прн перемешивании петро1

947 4 лейный эфир и.переносят в копонку . длиной 100 см и диаметром 35 см.

Смесь метиловых эфиров жирных кислот (0,84 r с содержанием .арахидоно- вой кислоты 67 ) растворяют в 10 мл петролейного эфира и наносят на колонку (соотношение нисших жирных кислот ВЖК и адсорбента 1:120) . Вещество элюируют последовательно петролейным эфиром, смесями: диэтиловый эфир — петролейный эфир (0,5:99,5), (1:99), (4:96), (1:9) объем фракций от 50 до 10 мл. Фракции, содержашие метиларахинодат чистотой 98Х (анализируют методами ТСХ и ГЖХ) объединяФ ют. Элюэнт упаривают и получают

0,44 г метиларахидоната указанной чистоты. Строение арахидоновой кислоты доказано масс-спектрометрией.

Для анализа получали пирролидидовые производные жирных кислот. Масеспектрометрические исследования проводили на хромато-масс-спектрометре ..

"Финннган — 3200 Р" с автоматической системой обработки данных (энергия ионизирующих электронов 70 эВ, диапазон массовых чисел 40-420 а.е.м., температура источника ионов 120 С ° ,В максимумах пиков, реконструированных с помощью ЭВИ хроматограмм, l определяли времена удерживания и соотношения пиков характеристических ионов в масс-спектре. Эти параметры, а в ряде случаев и полные масс-спектры, использовали для идентификации жирных кислот.

Ъ

Пример 2. 6,8 липидов жгутикового,простейшего А.Conga подвер- гают щелочному гидролизу как в примере -1 и получают 3,53 г смеси жирных кислот с содержанием арахидоновой кислоты 20Х. Эту смесь кристаллизуют последовательно из ацетона при t -5 С и при t -25 С, согласно с примера 1 и получают остаток ненасыщенных жирных кислот 2,3 г с содержанием арахидоновой кислоты 37,5X.Этот остаток кристаллизуют с мочевиной в ацетоне как в примере 1 и получают 0,71 r смеси полиненасыщенных жирных кислот, содержащих 65Х арахиноновой кислоты, которую этерифицирувт по примеру f и получают 0,65 г метиловых эфиров полиненасыщенных жирных кислот.

Метиловые эфиры ВЖК подвергают хооматогоайии на колонке с силикагелем, импрегнированным нитратом сеуаб1132947

Составитель В.Брусиловская

Редактор Ан.Шандор Техред А.Бабинец Корректор В.Бутяга

Заказ 9886/8 Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035» Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал IIIIII "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4 ра (соотношение эфиров ВЖК и адсор. бента 1:150, элюируют как в примере 1. Получают 0,34 г метиларахидоната с чистотой 99Х.

Предлагаемый способ проще и экономичней, чем известный, так как имеет

7 стадий вместо 8.

В предлагаемом способе также отсутствуют сверхнизкие температуры

-30 — -70 С требующие затрат больо

) ших энергий. Лрахидоновую кислоту

5 получают с большей чистотой и с большим выходом. В способе используется сырье непищевого назначения.