Способ выделения сфингомиелина

 

СПОСОБ ВВДЕЛЕНИЯ СФИНГОМИЕЛИНА из сырья животного происхождения , включающий экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол, щелочной гидролиз липидного экстракта, и очистку сфингомиелина на колонке с силикагелем , отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целевого продукта, экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1:1 с добавлением 15-25 ьб.% воды от объема смеси , полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавв ленной соляной кислотой, щелочному гидролизу разбавленным раствором щелочи с последукицей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформметанол при их объемном соотношении

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

ОДИ

РЕСПУБЛИН аа 01) 4(51) СО F 910

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТЪФ

Н llBTOPCNOMV СВИДЕТЕЛЬСТВ (2 1) 3629497/23-04 (22) 26.07.83 (46) 07.01.85 Бюл. Ф (72) Э.Я.Костецкий, E.Ï.Íåäàøêîâñкая и Ю.А.Зилберс (71) Дальневосточный государственный университет, Институт биологии моря Дальневосточного научного центра

АН СССР и Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной биохимии Научно-производственного объеди нения "Биохимреактив" (53) 547.26 118.07(088.8) (56) 1. Бергельсон Л.Д. и др. Препаративная биохимия липидов. М.,"Наука","

1981, с. 259.

2. SweeIey С.С. Purification and

partiaI characterization of

sphingomyeIin from human pIasma.

J.Zipid Res„ 1963,, В 4, р.402-406.

3. KarIson К.А. и др. "The sphingoIipioI composition of bovine KianIy

cortex, meduIIa and papiIIa. Biochem.

Biophys.Acta, 1973, 3 6, У 3, р.317-335 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ СФИНГОИИЕЛИНА из сырья животного происхождения, включающий экстракцию липидов смесью хлороформ-метанол, щелочной гидролиз липидного экстракта и очистку сфингомнелина на колонке с силикагелем, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии процесса и повышения выхода целе ного продукта, экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1:1 с добавлением 15-25 об.Х воды от объема смеси, полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавленной соляной кислотой, щелочному Я гидролизу разбавленным раствором щелочи с последующей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформ- и

МФ метанол при нх объемном соотношении (4-5):(5-6) и сфингомиелина — смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 2:8.

1133275

Изобретение относится к химии фосфорорганических соединений, а именно к усовершенствованному способу выделения сфингомаелина, который находит широкое применение в 5 изучении структуры и функции мембран, в медицинских исследованиях, в частности, нри изучении патологии головного мозга .

Известен способ вццеления сфинго- 10 миелииа из говяжьего мозга путем экстракции из него липидов последовательно ацетономр этаноломр петро лейиым эфиром, двухкратным переосаждением в диэтиловом эфире с носледую-д щим выделением неочищенного сфиигозжелина путем растворения фракции сфингопи идов в смеси хлороформ-.. метанап (98:2), очисткой иа колонке с окисью алюминия с последующим мяг-20 кии щелочиьм гидролизом сфингомиелиновой фракции и ее нейтрализацией, растворением высушенного остатка в смеси петролейного эфира и метанола, осаждением ацетоном и .Очисткой на ко-25 лонке с силикагелем. Из 500 г мозга получают 1 г .сфингомнелина, что составляет 0,2Х от исходного субстрата (1) .

Однако этот. способ трудоемкий и длительныйр а выход сфингомиелина низкий.

Известен также способ выделения сфингамиелина, заключающийся в экст- И ракции липидов плазмы крови последовательно ацетоном, этанолом, смесью хлороформ-метанол (2: 1), разделении их на двух силикагелевых колонках, последующем мягком щелочном гидроли- @

se сфингомиелиновой фракции и дополнительной очистке яа колонке с силикагелем. Из 15 л крови (650 г плазмы) получают 94Î мг сфиигомиелина, что составляет О, 14Х от исходного субстрата(2 .

Однако этот способ технологически сложен, так как требует длительной экстракции кипящими растворителями (24 ч ацетоном и 36-48 этанолом}, 50 использования двух колонок с снликагелем для получения неочищенного сфингомиелина из .комбинированного этанольно-ацетонового экстракта и из хлороформ-метанольного экстракта 55 и дополнительной очистки грязного сфингомиелина на колонке .с силикагелем. Выход сфингомиелина низкий.

Наиболее близким к, изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ выделения сфингомиелина, заключающийся в четырехкратной экстракции липидов из говяжьих почек смесью хлороформ-метанол (2: 1), проведении мягкого щелочного гидролиза их, нейтрализации, последующем отделении жирных кислот и холестерина от липидов, устойчивых к щелочному гидролизу, колоночной хроматографией на силикагеле, колоночной хроматографии фракции сфинголипндов на

ДЭАЭ-целлюлозе с последующим разделением нейтральной и кислой ефинголипидных фракций колоночной хроматографией на силикагеле. Выход сфинго- миелина 96р5Х от исходного содержания сфингомиелина в субстрате (3) .

Однако известный способ характеризуется большой длительностью, сложностью технологии, так как требуется двухкратная очистка прбдуктов на колонке с силнкагелем и с ДЕАЕ-целлюлозной, а также недостаточно высоким выходом целевого продукта.

Целью изобретения является упрощение технологии процесса и повыше ние выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения сфингомиелина из сырья животного проис. хождения,экстракцию липидов проводят смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 1: 1 с добавлением 15-25 об.Х воды от объема смеси, полученный липидный экстракт подвергают кислотному гидролизу разбавленной соляной кислотой, шелочному гидролизу разбавленным раствором щелочи с последующей очисткой сфингомиелина путем пропускания его через одну колонку с силикагелем, элюированием примесей смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении (4-5):.

:(5-6) и сфингомиелина †.смесью хлороформ-метанол при их объемном соотношении 2:8.

Контроль за составом липидного экстракта, составом фракций, элюиру емых с колонки, и проверку чистоты полученного целевого продукта осуществляют с помощью микротонкослойной хроматографии на силикагеле и микроаналитических процедур.

Для этой цели используют однои двумерную хроматографию: 1 — сис3275

3 113 тема хлороформ-метанол-аммиак 65:25 5 на пластинке обнаружено одно пятно;

2 — хлороформ-метанол-25Х-ный аммиак

65;25:5 первое направление, хлороформ-ацетон-метанол — уксусная кислота (ледяная) — вода 30:40:10: 10:5 второе направление.

Двухмерная ТСХ показывает одно пятно, обнаруживающее P-положительную реакцию на молибдатный реактив, холин-положительную реакцию на реактив Драгендорфа.

Жирные кислоты: 16:0 (18,3), 17:0 (1,2), 18:0 (9, 7), 18: 1(0,4), 1 9;0 (0,6), 20:0 (5э9) э 20: 1 (0,2), 21:0 1$ (0,7),. 22:0 (34,1), 22:1 (1,4), 23,0 (5,5), 23:1 (0 6).ý 24:0 (14,5), 24:1 (6,4Х).

Мол. вес 810. Фосфора 3,76Х (теоретическое 3,8X). Фосфор-холин- 20 сфингозин-жирная кислота 0,98:1: 1,03:

:0,96 практическое значение (1:1: 1: 1 теоретическое).

Пример 1. Получение сфингомиелина из почек свиньи.

1. Получение экстракта. 270 г свежезамороженных свиных почек измельчают на мясорубке. Трижды экстрагируют смесью хлороформ-метаиол }:1 при со отношении ткань-растворитель 1:5, 1гомогениэируют 3 мин, добавлюят

;20Х воды и вновь гомогенкзируют

3 мин, фильтруют на воронке Бюхнера или центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10 мин. Объединенные экст3S .ракты разделяют на делительной воронке. Водный слой отбрасывают.

Хлороформ-метанольный слрй упаривают под вакуумом на роторном испарителе при 50 С. Из 270 г свиных почек получают 6,48 г общих липидов, из них фосфолипидов 86Х. В состав фосфолипидов входят, Х: сфингомиелин 19,7; фосфатидилхолин 27,4; фосфатидилэтаноламин 22,4; фосфатидилсерин 9,2; фосфатидилинозит 8,3; дифосфатидилглицерин 9, 1; дифосфатидилинозит 1,8; лизофосфатидилэтаноламин 1,4; лизофосфатидилхолин 1,3.

Добавка воды 15-25Х не влияет на выход конечного продукта. Снижение до 13Х приводит к отсутствию расслоения в системе, увеличение свыше

25Х ведет к уменьшению выхода конеч55 ного продукта. !

Получение экстракта. 270 r свеже замороженных свинных почек обрабатывают по примеру 1,1, но для экстрак-. ции используют систему хлороформ-метанол 2:1. Выход общих липидов

6,32 r, из них фосфолипидов 84Х.

В составе фосфолипидов 15,9Х сфингомиэлина. По сравнению с примером 1,1 содержание.сфингомиэлина в экстракте на 23Х меньше.

270 г свежезамороженных свинных почек обрабатывают по примеру .1, 1 но для экстракции используют систему хлороформ метанол 1:2..Выход общих

l липидов 6,35 г, из них фосфолипйдов

80Х. В составе фосфолипидов 17, fX сфингомиелина. По сравнению с примером 1. T содержание сфингомиелина в экстракте на 18Х меньше.

2. Получение сфингомиелиновой фракции. К общему липидному экстракту добавляют 1 н. НС1 в метаноле (на 6,48 г общего липидного экстракта 9 мл 1 и. НС1 в метаноле) -и инкубируют 30-40 мин при 37-40 С, нейтрализуют 1 н. NaOH в метаноле, добавляют 1 í. МаОН в метаноле . (на 6,48 г исходного липидного экстракта 80 мл 1н. Na0H в метаноле) и инкубируют 30-40 мин при 37-40 С..

К гидролизату добавляют 2 объема хлороформа и 1/5 ч дистиллированной воды. После разделения фаз верхнюю водную фазу отбрасывают, нижнюю хлороформную фазу проверяют на нейтральную реакцию и упаривают досуха на роторком нспарителе. В случае необходимости отмывку водой повторяют до получения нейтральной реакции.

Выход фракции 5,90 r. Фракция готова к нанесению на колонку.

Выделение сфингомиелина. Для разделения 5,9 г липидов используют

180 г неактивированного силикагеля марки Л 40/100. Отношение силикагеля к загружаемой фракции липидов 30:1.

Силикагель суспендируют в системе хлороформ-метанол (5:5) и загружают в колонку диаметром 4 см и высотой адсорбционного столба 28 см, т.е. отношение диаметра к высоте 1:7, объем колонки 300 мл. На верх кладут бумажный фильтр. Фракцию липидов в 100 мл смеси хлороформ-метанол (5:5) вносят в колонку и начинают процесс элюирования.

Для элюирования используют: 2, 1 колоночных объемов (0,63 л) смеси хлороформ-метанол 5:5, выиыва:от холе". стерни; 4,5 колоночных объемов

1133275

Составитель M Красновская

Техред Т.Маточка Корректор M.Mëêñèìèøèíåö

Редактор Н.Джуган

Тираж 354 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 9917/24

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектна, 4 (f ;35 л) смеси хлороформ-метанол »."6, элюируют метиловые эфиры жрных кислот и цереброзиды; 12 колоночных объемов (3,6 л) смеси хлороформ-метанол

2:8» вымывают сфингомиелин, выход про-5 дукта 995 мв с чистотой 99Х, что соответствует 99,5Х от исходного количества сфингомиелина в свиных почках и 0,37Х от исходного количества субстрата.

Пример 2. Зкстракт получают по примеру I. Выделение сфингомиелино. вой фракции проводят по примеру 1.

Выделение сфингомиелина. Подготов- 15 ку колонки ведут по.примеру t. Для элюции используют 5 колоночных объемов (1 5 л) смеси хлороформ-метанол

5:5, 5,5 колоночных объемов (1»65 л) смеси хпороформ-метанол A.:6» 12,5 20 коаоиочных объемов (3,75 л) смеси хло роформ-метанол 3:7 — вымывают сфинго-. миелин. Выход сфингомиелина 900 мг, чистота 93Х.

Пример 3. Экстракт получают

; по npweyy 1. Выделение сфингомиелииовой фракции проводят по примеру 1.

Выделение сфингомиелина. ПодготоВ=.. ку колонки ведут по примеру 1. Для злюирования используют 5,5 колоночных объемов (1,65 л) смеси хлороформрюетанол 5:5. 10 колоночных объемов (3,0 л) смеси хлороформ-метанол 3:7, 4,5 колоночных объемов (1,35 л) смеси хлороформ-метанол 2:8. Выход сфингомиелина 1 r, чистота 85Х, загрязнен цереброзидами.

Использование предлагаемого способа получения сфингомиелина по сравнению с известным позволяет повысить выход целевого продукта до

99,5Х, а также быстро, просто и без больших потерь получить хроматографически чистый продукт за счет удаления плазмалогенов при мягком кислотном гидролизе и дальнейшего выделения сфингомиелина на единственной колонке с силикагелем путем злюирования примесей смесью хлороформ-метанол (4-5):(5-6) и сфингомиелина — смесью хлороформ-метанол (2:8). Сфинго" миелин, полученный по предлагаемому способу, значительно дешевле (в 21 раз) чем по известному.