Способ получения конъюгатов полициклических ароматических углеводородов с белками

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИО КОНЬЮГАТОВ ЮЛИЦИКЛИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ С БЕЛКАМИ, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками, о т л и ч а Ю щ и и с я тем, что, с целью упрощения процесса получения целевого продукта, активацию углеводородов проводят в присутствии-белка, солей двухвалентного железа и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:5:0,06:5,4 - 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидазы и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:1,5:0,3:0,35 - 1:5:5:12 при рН 7,4-8,0. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУВЛИН

09) (И) 4(51) А 61 К 39 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЭОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛВСТВУ

Ф.. 4

1 (21) 3559037/28-13 (22) 07.01.83 (46) 15.02.85. Бюл. 9 б (72) Л. А. Пирузян, .И. Е. Ковалев, О. Ю. Полевая, Н. П. Данилова, Т. Н. Робакидзе, С., Л. Шумова и Н. Ю. Томкпина (71) Научно-исследовательский институт по.биологическим испытаниям химических соединений (53) 577.15(088.8) (56) 1 ° Hethods in enzymology.. Xed. .Colowick S. P., Карlan N. О., !876, ч, 44, NY, London, р. 53-65.

2. Creech Н. J „ Jonus R. N. The

conjugation of Horse Serum Albumin

With Isocyanates .of Certain Polynuclear Aromatic Hydrocarbons.

J. Amer. Chem-. Soc. 63, 1941, М 6, р. 1661-1669. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЮ КОНЬЮГАТОВ

11ОЛИЦИКЦИЧЕСКИХ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ С БЕЛКАИИ, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками, о т л и ч а— ю щ .и и с я тем, что, с целью упрощения процесса получения целевого продукта, активацию углеводородов проводят в присутствии. белка, солей двухвалентного железа и перекиси водорода при соотношении компонентов

1:5:0,06:5,4 — 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидазы и перекиси водорода при соотношении компонентов 1:1,5:0,3:0,35 — 1:5:5:12 при рН 7,4-8,0., Е

1 11394

Изобретение относится к иммунохимии, конкретно к способу получения конъюгированных антигенов (полициклический ароматический углеводородантигенный носитель), которые могут .найти применение в медицине и биологии для получения антител к канцерогенным полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), нейтрализации канцерогенного действия ПАУ и для определения концентрации и локализации ПАУ в жидкостях и тканях организма.

Известны способы получения коньюгатов белков с различными полимерами Ц.

Однако они не предназначены для связывания белков с растворимым ПАУ.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности к достигаемому положительному эффекту является способ получения конъюгатов полициклических ароматических углеводородов с белками, включающий активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками. Активация углеводородов заключается в получении изоцианатных производных .и их отделении от реакционной смеси, затем изоцианатные производные углеводородов вво 30 дят в реакцию с белками $2(.

Не остатками этого способа являются длительность и трудоемкость процесса, Реакционноспособное производное ПАУ получают в несколько стадий. В ходе синтеза необходима очистка промежу-. З5 точных производных, применение большого .количества растворителей, концентрированных кислот и токсичных веществ (фосген), Ъ

Целью изобретения является упрощение процесса получения целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, способом получения конъюгатов полициклических ароматических углеводоро45 дов с белками, включающим активацию углеводородов и их ковалентное связывание с белками, активацию углеводородов проводят в присутствии белка, солей двухвалентного железа и

50 перекиси водорода при соотношении компонентов 1:5:0,06:5,4 — 1:5:2:20 соответственно или белка, пероксидазы и перекиси водорода при соотношении компонентов }:1,5:0,3:0,35 — I:5:5:1255 при рН 7,4-8,0.

Сущность. способа заключается в использовании для активации свобод38 2 ных радикалов. Реактив Фотона (смесь солей двухвалентного железа и перекиси водорода и пероксидаза генерируют гидроксильный или супероксиданионный радикалы, способные окислять и гидроксилировать различные органические соединения. В присутствии этих реагентов углеводороды связываются ковалентно с антигенным носителем.

Различие между двумя вариантами заключается только в том, что для генерирования свободных радикалов во втором случае используется,не реактив

Фентона, а фермент.

При осуществлении способа по первому варианту к водному раствору бел. кового антигенного носителя (рН

5-8), добавляют углеводород, соль двухвалентиого железа и перекись водорода в указанном соотношении. о

Смесь перемешивают при 0-25 С в течение 24 ч. Полученный конъюгированный антиген очищают фильтрацией и гель-хроматографией на сефадексах.

Содержание углеводородов в конъюгированных антигенах определяют спектрофотометрически по интенсивности

-1. поглощения в области 30000-24000 см по сравнению с эталонными растворами

ПАУ. В зависимости.от соотношения .компонентов реакции получают конъюгированные антигены, содержащие 114 моль ПАУ на 1 моль белка.

Для получения конъюгированных антигенов ПАУ-антигенный носитель по второму варианту предлагаемого способа к 0,5Х-ному водному раствору антигенного белкового носителя (рН 7-8) по каплям при перемешивании вносят раствор ПАУ в диоксане, водный раствор пероксидазы хрена и перекись водорода в указанном весовом соотношении. Смесь перемешивают прн 02 5С в течение 10 мин, затем очищают от ннзкомолекулярных продуктов реакции и пероксидазы хрена хроматографией на акрилексе П-60. Количество ПАУ в конъюгированном антигене определяют спектрофотометрически по интенсивности поглощения в области

30000-24000 см . В зависимости от соотношения компонентов реакции получают конъюгированные антнгены, в которых с одной молекулой белкового носителя ковалентно связаны 1-2 молекулы

ПАУ.

При осуществлении предлагаемого способа, по сравнению с известным достигается значительное упрощение тех438 4 з 1139 нологии (проведение реакции в одну стадию вместо четырех без очистки и выделения промежуточных продуктов, исключение целого ряда реагентов и растворителей, убыстрение процесса в 3-5 раэ). Это возможно в результате использования нового приема активированпя ПАУ для присоединения их к белку, которое. осуществляется непосредственно в присутствии белка, беэ

10 вьщеления промежуточного реакционноспособного производного ПАУ. Соотношения ПАУ, белкового носителя и веществ, используемых для активирования ПАУ (реактив Фентона или перок15 сидаза хрена в смеси с перекисью водорода), выбрано в таких пределах, при которых образуется конъю ированный антиген оптимального качества, т.е. содержащий 2-20 моль ПАУ на

1 моль белка. При меньшем количестве

ПАУ в конъюгате ухужшаются его антигенные свойства, при большом замещении возможны нежелательные побочные эффекты при иммунизации .животных, кроме того, ухудшается раство25 римость конъюгатов. Выбранный интервал температур и величина рН позволяют проводить реакцию конъюгирования с достаточной скоростью при стабильности белкового носителя. 10

Пример !. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен-бычий сывороточный альбумин.

50 мг бычьего сывороточного альбу. мина растворяют в 2 мл фосфатного 35 буфера рН 7,4 и 3 мл воды, добавляют !

О мг (38 ° 10 M) метилхолантрена, 0,63 (5 ° 10 M)FeSOq ° 7Н О и 0,165 мл

1,32 ° 10 > M ЗЗХ-ной перекиси водорода. Сме ь перемешивают при комйатной 40 температуре в течение 24 ч. Полученный конъюгированный антиген метилхолантрен — бычий сывороточный альбумин очищают фильтрацией и гель-хроматографией на сефадексе 6-25. С одной 45 молекулой белка в конъюгате по данным спектрометрии ковалентного связано

14 молекул метилхолантрена.

Пример 2. Способ получения конъюгированного антигена метилхолан- 50 трен-- бычий сывороточный альбумин.

50 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 3 мл воды и 2 мп ацетатного буфера рН 8,0. К раствору добавляют метилхолантрен, соль железа5S и перекись водорода в соотношении, указанном в примере 1, дальнейшую обработку реакции проводят аналогично примеру !. Получают конъюгированный антиген, в котором с одной молекулой белка ковалентно связаны 2 мо лекулы метилхолантрена °

Пример 3. Способ получения конъюгированного антигена метилхолан.трен — человеческий сывороточный альбумин.

50 мг человеческого сывороточного альбумина растворяют в 3 мл воды и

2 мл фосфатного буфера рН 7,4. К раст вору добавляют 10 мг (38 ° 10 6M) метилхолантрена, 20 мг (1,6 !0 М)

FeS0y ° 7Н20 и 0,6 мл (5 ° 10 5М) ЗЗХной перекйси водорода. Смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре, после очистки на сефадексе G-25 получают конъюгат, в котором с одной молекулой белка ковалентно связа но 5 молекул метилхолантрена.

Пример 4. Способ получения конъюгированного антигена метилхолантрен — бычий сывороточный альбумин.

15 мг бычьего сывороточного альбумина растворяют в 2.мл фосфатного буфера, рН 7,4 и по каплям при перемешивании добавляют раствор 3 мг метилхолантрена в О,l мл диоксана. К полученной смеси добавляют 15 мг пероксидазы хрена в 0 5 мл фосфатного буфера и 1 мл 3,5Х-ной перекиси водо. рода, Реакционную массу перемешивают

lO мин при комнатной температуре, образовавшийся конъюгат очищают на акрилексе П-60. По данным спектрофотометрии полученный конъюгат метил. холантрен — бычий сывороточный альбумин содержит 2 моль метилхолантрена на l моль белка.

Пример 5. Способ получения конъюгированного антигена бензпирен . бычий сывороточный альбумин.

К раствору 15 мг бычьего сывороточного альбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют 10 мг (4,2 ° 10 5И) 3,4 бенэпирена в минимальном количестве диоксана, 3 мг пероксидаэы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,5 мл (3 ° 10 4М) 3,5Х-ной перекиси водорода. Смесь перемешивают

10 мин и очищают конъюгированный антиген бензпирен — бычий сывороточный альбумин хроматографированием на акрилексе П-60. По данным УФ-спектра в полученном конъюгате.2 моль бензпи. рена связаны с 1 моль белка.

Пример 6. Способ получения конъюгированного антигена бензпиренчеловеческий сывороточныи альбумин, 1

Составитель И. Привалов

Редактор Н, Швыдкая. Техред Т.Фанта Корректор И. Эрдейи

Тираж 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 163/4

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная . 4

3 I

К раствору 15 мг человеческого .сывороточного апьбумина в 3 мл фосфатного буфера рН 7,4 добавляют

10 мг (4,2 ° 10 М) 3,4-бензпирена в минимальном количестве диоксана, 3 кг пероксидаэы хрена в 0,5 мл фосфатного буфера и 0,1 мл (6 ° 10 М) 3,5 -ной перекиси водорода. Смесь перемешивают

10 мин при комнатной температуре и очищают конъюгированный антиген бензпирен — человеческий сывороточный .альбумин хроматографией на акрилексе

П.60. По данныи УФ-спектров в.полученном конъюгированном антигене с 1 моль белка ковалентно связан 1 моль бенэпирена.

Таким образом, в предлагаемом способе получения конъюгированных с

139438 6 белками ПАУ по сравнению с известным существенно упрощена технология процесса. В известном способе конъюгат

ПАУ.-белок получают в четыре стадии в течение 10-11 дней, а в данном реакционноспособное проиэнодство ПАУ генерируют в присутствии антигенного носителя, поэтому процесс получения конъюгированного антигена прохо10 цит в одну стадию в течение 2 дней.

Отпадает необходимость выделения и очистки промежуточных производньпсу исключается целый ряд реагентов и ра. створителей (концентрированные азот-. ная, соляная, уксусная" кислоты, хлорид олова, концентрированный раствор аммиака, бензол, толуол, лигроин!; в том числе токсичный реагент — фосген.