Способ обработки спермы сельскохозяйственных животных

 

СПОСОБ ОБРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий разбавление цельной спермы, эквилибрацию и замораживание в парах жидкого азота, о тличающи йс я тем, что, с цепью стабилизации биологической полноценности, цельную сперму перед разбавлением смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд.спермиев. (О 4 О) СО 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

4(5 ) А 61 D 7/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPGHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Фиг.1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3599570/30-15 (22) 03.06.83 (46) 15. 03. 85. Бюл. № 10 (72) А.А. Чуйко, В.Е, Недава, В.К. Пикалов, Л.А. Бегма, В.И. Богомаз, А.А. Бегма и В.М. Огенко (53) 636.082.453.5(088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

¹ 668677, . 61 D 7/02, 1979.

2. Авторское свидетельство СССР № 435819, кл. А 61 D 7/02, 1973.

3. Авторское свидетельство СССР

Ф 702365, кл. А 61 D 7/02, 1973, 4. Инструкция по организации и технологии работы станций и предприятий по искусственному осеменению . сельскохозяйственных животных. М,, "Колос", 1981 (прототип).

„„SU„„1144698 А (54) (57) СПОСОБ ОБРАБОТКИ СПЕРМЫ

СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ, включающий разбавление цельной спермы, эквилибрацию и замораживание в парах жидкого азота, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью стабилизации биологической полноценности, цельную сперму перед разбавлением смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд.спермиев.

4698

)1 114

Изобретение относится к способу искусственного осеменения сельскохозяйственных животных, а именно к способам дбработки и криогенного хранения спермы быков, и может быть использовано на станциях искусственного осеменения животных.

Известны способы обработки cnepf мы, включающие разбавление спермы защитными средами, ее охлаждение. 1О эквилибрацию и последующее замораживание в парах жидкого азота.

С целью сохранности биологической активности, сперму подвергают центрифугированию для удаления сек- 15 ретов добавочных половых желез fit .

Недостатком известного способа является разрушение целостности мембраны спермиев, что приводит к снижению жизнеспособности спермиев.

Известно также, что разбавленную сперму подвергают вакуумированию с последующим насыщением углекислым или инертным газами j2j . Часто сперму обрабатывают постоянным маг- 25 нитным полем (3) .

Недостатком таких способов является повышение стоимости спермы за счет использования дополнительного оборудования, рабочей силы и электро-ЗО энергии при относительно низком нов вышении активности спермиев.

Наиболее близким по технической сущности к предложенному является способ, заключающийся в разбавлении спермы защитной средой из расчета получить

10 млн.активных спермиев в одной оттаянной си рмодозе, охлажденииэквилибрации в холодильнике при температуре 5 С в течение.4-5 ч

40 и замораживании в парах жидкого азота до температуры — 196 С (4) .

Существенным недостатком известного способа является значительное

4 снижение биологической полноценности

45 спермы при ее замораживании, что выражается в гибели большого количества спермиев (30-70Е), .в нарушении их мембранных структур, снижении показателей выживаемости и подвиж50 ности, Целью изобретения является стабилизация биологической полноценности спермы в процессе замораживания.

Поставленная цель достигается 55 тем, что согласно способу обработки спермы сельскохозяйственных животных, включающему разбавление цельной спермы, эквилибрацию и замораживание в парах жидкого азота, перед разбавлением цельную сперму смешивают с метилаэросилом из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд. спермиев.

Способ обработки спермы сельскохозяйственных животных осуществляется следующим образом.

Свежеотобранную сперму оценивают согласно известному способу (4) и затем в зависимости от концентрации спермиев и общего количества полученной спермы в нее вводят метилаэросил из расчета 3-30 мг метилаэросила на 1 млрд.спермиев и перемешивают, Обработанную таким образом сперму разбавляют защитной средой, эквилибрируют при 5 С в течение

4-5 ч и замораживают в парах жидкого азота до температуры -196 С.

Было использовано 42 эякулята быков черно-пестрой и симментальской пород, принадлежащих ЦСИО (г. Бровары).

Взятие и оценку цельной спермы проводили по способу (4) . Каждый эякулят быка делили на две пробы, одну из которых обрабатывали метилаэросилом, а другую обрабатывали по известному способу (4) .

Пример 1. В пробы спермы вводили метилаэросил в следующих количествах: а) 3 мг/млрд. спермиев 12 проб спермы б) 15 мг/млрд.спермиев 10 проб спермы в) 30 мг/млрд.спермиев 15 проб спермы

Обработанную метилаэросилом пробу спермы разбавляли защитной средой из расчета 10 млн.активных спермиев в одной оттаянной спермодозе следующего состава:

Лактоза, r 11,5

Желток куриных яиц, мл 20

Глицерин, мл 5,0

Спермосан — 3 тыс. ед. 50,0

Вода дистиллированная, мл 100,0

Разбавленную сперму охлаждали в холодильнике до 5 С в течение 5 ч, а затем замораживали в виде гранул объемом 0,2 мл на фторопластовой пластине в парах азота.

Замороженную сперму хранили в жидком азоте при -196 С. Одновременно параллельные пробы тех же эякулятов обрабатывали известным способом

У т.е. без предварительного смешивания с метилаэросилом.

1 144698

Таблица 1

Доза метилСпособ обработки спермы

Подвижность спермиев, балл

Время, ч аэросила, мг/млрд. спермиев за

a) и = 12

7,98+0,32

5,25+0,171

35,5+2,02

Предлагаемый

4,75+0,139

21,2+3, 13

6,0 +0,315

Известный

67,4

Разница, Х 10,5

<0,05

<0,01 (0,01 б) и = 10

Предлагаемый*

5, 12ф0,128

8,25+0,63

28, 2+1, 89

6,28+0,41

22,0+2,018

7,8

Разница, Ж

31,4

<0,1 (0,1

1 в) и= 15

8,75+0,509

7,25+0,350

37,5+2,564

30,01-0,913

Разница, Е 3, 15

25 с0,1 с0,05 <О, 05

Биологическую полноценность спермы, обработанной известным и предлагаемым способами, оценивали по показателям подвижности и выживаемости спермиев согласно ГОСТУ 20909 4-75.

Подвижность определяли в раздавленной капле спермы под микроскопом в проходящем свете при увеличении в 100-180 раз с использованием нагревательного столика при 40-41 С. Оценку подвижности производили по десятибалльной шкале.

Выживаемость в часах определяли по количеству времени, прошедшего

Известный 4,75+0,221

Предлагаемый 4,90j0,125

Известный 4;75+0,250

Пример .2. В пробы спермы вводили метилаэросил в количестве

5 мг/млрд.спермиев — 5 проб. от размораживания спермы до ее гибели при хранении в термостате (t =

38 C) .

Для определения абсолютного показателя выживаемости (S ) проводили оценку подвижности оттаянной спермы, хранящейся при 38 С через каждый час до ее гибели. Суммарная подвижность спермиев за время их жизни и является абсолютным показателем выживаемости.

Результаты проведенных исследований изложены в таблице 1.

Выживаемость при 38 С

Обработанную метилаэросилом сперму разбавляли средой из расчета

10 млн.активных спермиев в одной от1144698 таянной спермодозе следующего состава:

Сахароза, г 11,5

Желток куриных яиц, мл 20,0

Глицерин, мл 5,0

Спермосан — 3 тыс.ед. 50,0

Вода дистиллированная, мл 100,0

Разбавленную сперму охлаждали в холодильнике до 5 С в течение 5 ч, а затем замораживали в виде гранул на фторопластовой пластине в парах азота. Замороженную сперму хранили в жидком азоте при -196 С.

Одновременно параллельные пробы тех же эякулятов обрабатывали известным способом, т.е ° без предварительного смешивания с аэросилом.

Биологическую полноценность спермы, обработанной известным и предлагаемым способами, оценивали по показателям подвижности и выживаемости

10 спермиев согласно ГОСТУ 20909,4-75.

Результаты исследования изложены в табл. 2 (и = 5).

Таблица 2

Показатель

Разница

Известный способ

Предлагаемый способ

4, 724 0,079 9, 8 О, 01

5, 18 "О, 121

6,27 0,324

25,69 2,08

32 - 0,01

50 - 0,01

8,27 -0,412

Время, ч

38,5-+2,99

Также провели цитохимические исследования сохранения активности ферментов — эндогенных дегидрогеназ в оттаянных образцах замороженной спермы, обработанных предлагаемым и известным способами. З5

Для этого сразу же после оттаивания и через 4 ч инкубации при 38 С по капле спермы смешивали на специальном предметном стекле с забуференным раствором тетразолиевой соли 4О

"Нитро ВТ (индикатор). Смесь термостатировали 30 мин 38 С, Делали мазок, фиксировали, докрашивали

О, 1%-ным раствором эозина, высуши— вали и оценивали под световым микроскопом при 900-кратном увеличении. Все спермии дифференцировали на 3 класса: 1-й — спермии, имеющие высокую активность дегидрогеназ;

2-й — спермии со слабой активностью дегидрогеназ; 3-й — спермии с отсутствием дегидрогеназ.

Результаты исследований изложены в табл. 3.

Таблица 3

Известный способ

Предлагаемый способ

После отта- Через 4 ч ивания инкубации

17,75

11,8

12,09

7,33

44,75

47,1

47,29

40,62

26,75

65,92

37,5

41,1

Подвижность спермиев, балл

Выживаемость при 38 С:

Активность дегидрогеназ в спермиях, Е

Спермии с высокой активностью, 7

Спермии со слабой активностью

Спермии неактивные, Ж

После отта- Через 4 ч ивания инкубации

A

% °

- 4 ." /

Ъ«

-1 .

Ъ. .aaQ ;"

)щЩЩЦ Заказ 1018/4 Тираж 722 По сное яп »

° г.Ужгород, ул.Проектная, 4

7 11446

Помимо перечисленных показателей было изучено состояние .цитоплазматической мембраны оттаянных спермиев после обработки их предлагаемым и известным способами. 5

Клетки рассматривались под электронным микроскопом при увеличении

Ф в 8,5 тыс.

На фиг. 1 показана электронограмма оттаянного спермия, обработанного изобретенным способом (электронный микроскоп х 8500); на фиг. 2 — электронограмма спермиев, обработанных контрольным способом (электронный микроскоп х 8500). 15

Приведенные в примерах результаты свидетельствуют о более высокой биологической полноценности спермы при применении предлагаемого способа обработки спермы животных в сравне- 20 нии с известным, являющимся базовым.

Это проявляется в увеличении подвижности спермиев на 9,8 (табл. 2)

10,57. (табл. 1) при статистически значимой разнице (р с0,05) в сравне- 25 нии с известным способом. Эти данные свидетельствуют о более высокой устойчивости спермиев к замораживанию.

Повышается время выживаемости оттаянных спермиев более чем на ЗОЕ (табл. 30

1 и 2) при р 0,01. Значительно увеличивается абсолютный показатель выживаемости 50Х (табл. 1 и 2) при ° р «с 0,01, что свидетельствует о более высокой жизнеспособности спермиев.

Кроме того, это проявляется в большом количестве спермиев с активными ферментами дегидрогенизами, т.е. с активно функционирующими митохондриями, снабжающими клетки энергией (17,757 при предлагаемом способе обработки спермы, 12,097 при известном).

Спермиев с неактивными дегидрогеназами (т.е. не вырабатывающих энергию — мертвых) меньше при предлагаемом способе обработки (37,57), чем при известном (40,62X). Этот уровень мертвых спермиев остается без изменения в течение 4 ч инкубации при

37 С, в то время как при известном способен уровень мертвых спермиев возрастает до 65,927.

Кроме того, исследование микроструктуры оттаянных спермиев показало, что применение предлагаемого способа обработки спермы значительно лучше сохраняло мембранную структуру спермиев при замораживания.

На фиг. 1 видно, что цитоплазматическая мембрана этих спермиев компактная, не имеет повреждений, в то время как после обработки спермы известным способом в цитоплазматической

3 мембране оттаянных спермиев имеется много структурных изменений (фиг.2).

Все данные свидетельствуют о значительной стабилизации биологической полноценности спермиев при обработке спермы данным способом.