Способ количественного определения трийодтиронина
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИН
lI91SUilii 1
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Н ПАТЕНТ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГТИЙ (21) 2589948/28-13 (22) 15.03. 78 (31) 21231 (32) 15.03.77 (33) Италия (46) 23.05.85. Бюл. Р 19 (72) Пьерлуиджи Ренци и Витторио Барончелли (Италия) (71) Снампрогетти С.п.A. (Италия) (53) 616-07(088.8) (56) 1. J. Chopra et а1. Radioimmunoassay for Measurement of. Triiodotnyronine of «man Serum.
The J. of Clinica) Investigation, 1971, v. 50, р. 2033 (прототип). с. А 61 В 10/00;, .Г 01 М-33/53 (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДГЛЕНИЯ TPHAOJlTHPOHHHA в сыворотке крови путем постановки иммунологической реакции, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, к сыворотке крови добавляют антитела против трийодтиронина, сорбированные на инертном носителе, полученную реакционную смесь пропускают через колонку, содержащую трийодтиронин, конъюгированный с карбоангидразой при молярном соотношении
1:1, затем колонку промывают, вносят в нее субстрат фермента, преимущественно ацетат паранитрофенола, и концентрацию трийодтиронина определяют по количеству несвязавшегося фермента.
1158029
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для выявления трийодтиронина в сыворотке крови.
Известен способ количественного 5 определения трийодтироника в сыворотке крови путем постановки иммунологической реакции — радиоиммукологического метода !1).
Однако известный способ является трудоемким, так как предусматривает использование меченых антител, при этом данный реагент нестабилен, так как теряет радиоактивность в процессе хранения и требует постоян-!5 ного приготовления перед постановкой ре акции.
Цель изобретения — упрощение способа, Поставленная цель достигается 20 тем, что согласно способу количественного определения трийодтирокина в сыворотке крови путем постановки иммунологической реакции, к сыворотке крови добавляют антитела против трийодтиронина, сорбированные на víåртком носителе, полученную реакционную смесь пропускают через колонку, содержащую трийодтиронин, коньюгироваккый с карбоангидразой ЗО при молярном соотношении 1:1, затем колонку промывают водой, вносят в кее субстрат фермента, преимущественно ацетат паранитрофенола, и концентрацию трийодтиронина определяют по количеству несвязавшегocR фермента, Пример 1. Получение антитрийодтирони н-антител.
S0 мг бычьего сероальбумина
4,"» (BCA) растворяют в 25 мл воды и к этому раствору добавляют 150 мг
1-этил-3-(3-диметиламинопропил) к арбодиимида. Затем по каплям добавляют 00 мг трийодтиронина растворен- ного в 5 мл N,N-диметилформамида.
По истечении 5 мин добавляют SO мг
1-этил-3-(3-диметиламинопропил) к арбо диимида.
Реакция протекает в течение 18 мин 1О при комнатной температуре в темноте и перемешивании. После завершения реакции образец подвергают центрифугированию и диализу с частой заменой дистиллированной воды в течение
72 ч.
Число остатков трийодтиронина, включенных в каждую молекулу альбумина, определяют спектрофотометрическим методом с к-пользованием коэффициента б100 . см к» 320 км.
Рез "fьтать. показыг»ают, »i To с Yаждой молекулой БСА сопряжено око lо пяти о. тятков трийодтирокика СТ, ) .
Антитела получены послеповатес»ьными иммунизациями кроликов сопряженной струковуpoA T> — БСЛ. Для титровакия антител используют метод пассив". ой агглютинации. Зто классическая метс>дика серологии заклю .ается в iici Полученные актктсьча имеют индекс 1:8000. Очистку антител осуществляют с помощью центрифугировакия сыворотки и разбавления всплывающей жидкости одним объемом воды и одним объемом насыщенного раствора сульфата аммония с достижоHHEì конечной концентрации 33Х. По истечении 15 мик смесь ентрифугируют в течение 20 мик при 4000 об/мик и осадок вторично суспеклируют в солевом растворе к снова высаживают с использованием сульфата аммония до тех пор, пока ке достигнут полного обосцвечивакия раствор», Orадок, отобранный сопевши раствором, подвергают диалияу с двумя сменами (или столбик »» солевого раствора при 4 С,» до тех пор, i ока ке достигнут удаления сульфата аммония полностью. Пример 2. 11олучекие иммукои огл о яаю1цих акт ител на полках риламиде . Биогель Р-300 обрабатывают в течение 24 ч в воде дпя его гидратации и многократко промь»вают той же сре1 дой, Е 100 мл гидратиронакного геля добавляют 500 мл»5Х-ного раствора г:<утарового ал:,дегида в 0,1 If фосфатном буфере при рП 7,0. Раствор иккубируют в теченйе ночи при 37 С. Затем гель промывают 10-20 раз водой, используя 500 мл для каждой и ромывк и. 10 мл активировакного геля смешивают с 12 мл сыворотки крови. Раствор медленно перемешивают при комнатной температуре в течение 14 ч, центрифугируют в течение 10 MHH upu 3000 об/мин и 4 С и всплывающую >кидкость отделяют для определения ко! 5802с1 I«p. нич тожны, Тираж 722 Подписное ВНИИПИ Заказ 3396/57 Филиал ППП "Патент", г.Ужгород, ул,Проектная, ЛIH 1С«С TB Я Л Н ТИТЕ 51 К nТОР111«Н Е IIО Г«1 пщены. 1!Яст««!п1 геля -1атс м промывают иэотоническим буфер« ым (яс т1«ором до тех пор, пока оссти11ес«сля п.«отность Г«сппываю111его с«1оя жидкости не с Tлнет ниже 380 нм. Количество сопряженных антител 23 мг на 1 мп геля. Пример 3. Попучение сопряженной структуры трийодтиронинл Т кл11боЯн« идрЯЯ Я (T> h(A) !О 50 мг клрболнгидрлэь1 рястноряют в 25 мп воды и смешиплют с О мг 1-этип-3 — (3-диметипямино««ропип) кярбодиимидл, клппями доблвс«яют 20 мг Т» растноренного н 5 мп М,Nс-диме- !5 типформамида, при IpM попдерж!«шлют рН 5, 5-6, О, Раствор выдерживают при комнатной температуре и непрерынном перемешинлнии в теми JTp. в течение приблизительно 18 ч. По эанерше- 20 нии этой стадии образец центрифугиру1от и диапизируют с частой сменой воды при 4 С в. течение 48 ч, Спектрофотометрический анализ показывает, что остаток Т сопряжен с 25 одной молекулой карбоангидразы. Остаточная ферментативнля активность сопряженной структуры соответствует приблизительно 507- активности !«Сходного фермента. Сопряженнял струк- «0 тура Т БСЛ гомогенна и отпичяется от исходного фермента. Пример 4. Определение трийодтиронина, Вначале нычерчиняют криную кяпибровк!«, что пров одят в с оо тнетс тнии со следующим. 1 мп инсопюбипиэированных на биогепе P-300 лнтитеп помеща1от в колонку (О, 5 О, 5 см), Термостатически выдерживаюшуюся при о 25 С, Через колонку пропускают 1 мп раствора, r oäcpJI ïùåãо сопряженную с труктурн Т1 БСА при конце нтр лции 0> 5 м. колонку оставпя«от н псское HB 1 ч, затем промынают 1 мп 1«эотонического раствора и опредепя«от по нытеклсощему продукту остато «ную биологическую активность сопряженной структуры, Биологическую активность сопряженной структуры g БСЛ определяют при 25 С спектрофотометрическим методосм измерением упепичения погпощения на 348 HM ffc Ipдствие гHJIpoJII« эл, ныэнанного сс -нитрофениплцетлтом, 5э 1 ."«."1 JJI Ixo J Ппя определения трийодтиронина постепенно возрастающие количества сяободного гормона (от 3 до 70 и/мп) помс шлют н раэпичные колонки, каждал я 3 ко торь«х со JNржит 1 мл «1«coJI!«J бипиэиронанных антитеп, причем испытлтепьнь«е сосуды останпяют ныстаивлться нл 1 ч. Смопу прсмь«вают с помо«пью 5 мп изотонического раствора (буфер1, вновь эпюируют 1 мп О, 5 мМ Т> БСЛ и остлв11яют на 1 «. Смопу ннс вь промывают 1 мп изотонц«ес.— кого бус«1ера и определяют по выходящему продукту специфическу«о актинность сопряженной структуры Т, БСЛ, !ынимлпьное код!«чество, которое может быть измерено, состав!!лет 1-? нг. Пример 5. Опредепен««е тРпйодтиРонпна Тз в стлнГ«,аРтной чепонеческой сыноротке. Согплсffo уклэлнной метсдике проГ«о«ят анл.1из трех стандартных сывороток гппo вЂ, зу- и гипертироидных плци. ентов и получают соответственно 110, 236 11 500 кг на 100 мп. Эти I«eJlz«чины хорошс согласуются с измерениями радио!«ммунопогическим методом. Специ«1>!««ность антител, попученньсх предJ1лгле;псм cllосс бом, оценивают измерением способности тироксина Т» к онк урир с нять с трийодтиронином Т. IJ отношении янтисынорот«си, ITJIII обеc печения специфической лкт!«в««ости сопряженной структуры Т«БСА, которая эквинлпентнл вызванной 2 нг Т» требуется 500 мкг Т. Бсии учесть, что нормальная концентрация Т+ в челонеческofl сыпоротке составляет около 80 мг/1«JI, то можно считать,что соэдаваемь«е помехи B измерительной систеПредлагаемый способ позволяет определять трийодтиронин н крайне небольших копичествах, что ванно дпя диагностических цепей, и упростить опредепение.
