Способ определения производных бензимидазола в биологических объектах

 

1. СПОСОБ ОПРЕЛЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстракцию его органическим растворителем, очистку экстракта от коэкстрактивных веществ, упаривание экстракта, хроматографирование на пластинах Силуфол УФ-254 и идентификацию производных бензимндазола путем облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в качестве органического растворителя в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона в соотношении 2:11:2 с последующей элюцией производных бенэимидазола хлороформом. 2. Способ по п. 1,отличаю щ и и с я тем, что, с целью повышения специфичности способа путем обеспечения возможности дополнительного определения фенбендазола в био (Л логических объектах, хроматограммы после облучения ультрафиолетовым светем обрабатывают свежеприготовленной смесью 2,5%-ного раствора треххлористого железа в 50%-ном водном ацетоне и 0,25%-рого раствора калия гексацианоферрата III в Сд 50%-ном водном ацетоне в соотношеел нии 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110 С до появления пятен препарата голубой окраски. |i

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (!9) (I I J

4(y)) G 01 N 30/94

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ. б

":-., 1

-;.- 1

Г й..М. б:б .

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

° б б

° °

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3645000/30-15 (22) 27.07.83 (46) 07,07.85. Бюл. У 25 (72) А.А.Кузьмин, В.И.Ярошенко, О.А.Малинин, В.Д.Шуляк и В.С.Шеховцов (71) Украинский ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии (53) 547.5(088.8) (56) 1"."J.Phasm.Sci", 1980, 69, с.442.

2. Бюллетень Всесоюзного института гельминтологии, 1981, 28, с. 77.

3. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания, кормах и внешней среде, ч. UI т.II °

М., 1974, с. 363. (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БЕНЗИМИДАЗОЛА В БИОЛОГИЧЕС

КИХ ОБЪЕКТАХ, включающий экстракцию его органическим растворителем, очисте ку экстракта от коэкстрактивных веществ, упаривание экстракта, хроматографирование на пластинах Силуфол УФ-254 и идентификацию производных бензимидазола путем облучения б ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения чувствительности и точности способа, в качестве органического растворителя в процессе экстракции используют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона в соотношении 2:11:2 с последующей элюцией производных бензимидазола хлороформом.

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что, с целью повышения специфичности способа путем обеспечения возможности дополнительного определения фенбендазола в биологических объектах, хроматограммы после облучения ультрафиолетовым светом обрабатывают свежеприготовленной смесью 2,5Х-ного раствора треххлористого хелеза в 50Х-ном водном ацетоне и 0,25Х-ного раствора калия гексацианоферрата Ш в

50Х-ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110 С до появления пятен препарата голубой окраски.

1165984

Изобретение относится к санитарии и фармакологии и может быть использовано для санитарно-гигиенической оценки продуктов животноводства после применения метил-N-(2-бензимидазолил)карбамата (БИК) и фенбендазола в качестве лечебных препаратов и разработки рациональных методов. терапии животных при гельминтознйх заболеваниях. 1О

БИК структурной формулы и фенбендазол (метил-5-(фенилтио) —, -2-беизимидазолкарбамат) структурной формулы

Я ян-со-осн, 25

Н широко применяются для лечения гельминтозов животных. Кроме того, БИК используется в растениевод«стве как системный фунгицид. ЗО

Производные бензимидазола, к которым относятся фенбендазол и БИК, обладают отрицательным действием на организм млекопитающих, в частности эмбриотоксическим эффектом.

Поэтому необходима санйтарно-гигиеническая оценка продуктов животноводства, полученных от животных после применения этих лечебных препаратов. 40

Известен способ определения фенбендазола в биологических жидкостях (плазме крови, рубцовой и сычужной жидкостях) с помощью жидкостной хроматографии. Способ вклю- 45 чает экстракцию фенбендазола из биологических жидкостей эфиром, который затем упаривается досуха,». а остаток растворяется в метаноле и подвергается хроматографическому ана- 5О лизу (1).

Недостатком данного способа является его непригодность для определения фенбендазола в тканях животных (мышцы, печень, жир), так как в нем 55 не предусмотрена очистка экстрактов.

Кроме того, способ требует наличия специального дорогостоящего оборудования и включает использование метанола - высокотоксичного вещества, для работы с которым необходимо специальное разрешение.

Известен также способ определения производных бензимидазола — бенацила и БИК в тканях животного происхождения спектрофотометрическим методам. Способ основан на извлечении бенацила и БИК из проб хлороформом, отделении препаратов от мешающих примесей 10%-ным раствором серйой кислоты и последующем спектрофотометрировании проб при двух длинах волн — 281 и 295 нм. Чувствительность метода 0,5 мг/кг 12 .

Недостатками способа являются низкая чувствительность определения БИК, необходимость параллельного исследования контрольных проб (аналогичных тканей, не содержащих

БИК) и недостаточная очистка экстрактов.

Наиболее близким по технической сущности к изобретению является

Хроматографический метод определения остаточных количеств арилата (бенлата) по БМК в растительных объектах, почве и воде. Способ основан на извлечении БИК из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта перераспределением в солянокислую среду, а затем после подщелачивания, в этилацетат с последующим определением методом тонкослойной хроматографии в системе подвижных растворителей этилацетат-хлороформ-ледяная уксусная кислота (50:50:10) на пластинах

Силуфол УФ-254. Чувствительность способа 0,2 мг/кг (10 мкг в пробе) для огурцов; 0,3.мг/кг (10 мкг в про— бе) для яблок и 0,75 мг/кг (15 мкг в пробе) для почвы. Процент определе ния составляет 70-90 f3).

Недостатками известного способа являются низкая чувствительность определения (10-15 мкг препарата в пробе), невозможность его применения для определения фенбендазола и БИК в тканях животных из-за недостаточной очистки экстрактов и использования больших количеств этилацетата (350 мл на одну пробу).

Цель изобретения — повышение чувствительности, точности и специфичности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве органическ6го

984 з ° 1165 растворителя в процессе экстракциииспользуют хлороформ или эфир, очистку от коэкстрактивных веществ осуществляют на колонке с окисью алюминия смесью эфира и ацетона, в соотношении 2: 1-1:2 с последующей элюцией производных бензимидазола хлороформом.

Для обеспечения возможности дополнительного определения фенбеидазола хроматограммы после облуче.ния ультрафиолетовым светом обрабатывают свежеприготовленной смесью

2,5 -ного раствора треххлористого железа в 50 -ном водном ацетоне и

0,25Х-ного раствора калия гексацианоферрата III в 50Х-ном водном ацетоне в соотношении 3:1-1:5 с последующим нагреванием пластин при 90-110 С до появления пятен

20 препарата голубой окраски.

При экстрагировании выявляемых. .препаратов :. из биологических объектов одновременно извлекается большое количество коэкстрактивных 25 веществ (жиры, пигменты), которые мешают при конечном определении препаратов тонкослойной хроматографией. Для удаления коэкстрактивных веществ проводят упаривание экстрактов досуха, сухой остаток смывают небольшим количеством эфира, не допуская конденсации воды, и вносят в хроматографическую колонку. Колонку наполняют последовательно безводным сернокислым натрием Ç5 высотой 1 см, окисью алюминия высотой 1,5 см и слоем безводного сернокислого натрия высотой 1 см. Дпя увеличения скорости потока элюирующих растворов через колонку при 40 очистке экстракта в качестве адсорбента используют окись алюминия с размером частиц 80-125 меш.

Очистка экстрактов от примесей основана на том, что фенбендазол 4> и БИК адсорбируются на окиси алюминия и не элюируются определенным количеством смеси эфира и ацетона, которая в то.же время хорошо элюирует коэкстрактивные вещества. При исполь-5о зовании колонки с указанными параметрами используют 10 мл смеси эфира и ацетона в соотношении 2:1-1:2. После удаления коэкстрактивных веществ препараты вымывают из колонки 25 .- М

30 мл хлороформа. Эфир-ацетоновый

:элюент отбрасывают, а хлороформный упаривают до объема 0,2-0,3 мл и

4 наносят на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254. После развития хроматограммы в системе подвижных растворителей пятна препаратов выявляют в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Фенбендазол и БИК обнаруживают в виде сиреневых пятен на зеленом флуоресцирующем фоне.

Кроме того, для определения фенбендазола используют свежеприготовленную смесь 2,5Х-ного раствора треххлористого железа в 50 -ном водном- ацетоне и 0,25Х-ного раствора калия гексацианоферрата III в 50Хном водном ацетоне в соотношении

3:1-1:5, После опрыскивания пластин их выдерживают при 90-110 С до появления голубых пятен фенбендазола на желто-зеленом фоне.

Pf фенбендазола в системе подвижных растворителей хлороформ-этанол (20-1) составляет 0,35-0,45, BMK—

0,45-0,55. Поэтому для достоверного дифференцирования их между собой проводят дополнительное опрыскивание пластин смесью растворов треххлористого железа и калия гексацианоферрата III. При этом фенбендазол проявляется в виде голубых пятен на желто-зеленом фоне после нагревания пластин, а БМК, в отличие от фенбендазола, данным реактивом не проявляется. Оптимальные результаты при обнаружении пятен фенбендазола получают при опрыскивании. пластин смесью 2,5 -ного водно-ацетонового раствора треххлористого железа и

0,25 .-ного водно-ацетонового раствора калия гексацианоферрата III в соотношении 3:1-1:5.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Навеску 10 г мяса, 5 r печени, 5 г жира, 10 г почек измельчают, помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 15-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Затем хлороформный или эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку. К пробе повторно добавляют 10-15 мл хлороформа или эфира, встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции раст» ворителя.. Объединенный экстракт упаривают на водяной бане при бО80 С. Сухой остаток смывают эфиром двукратно порциями по 2-3 мл и вио5 сят в стеклянную колонку с внутренним диаметром 8-9 мм, содержащую

1,5-сантиметровый слой окиси алюми-, ния для хроматографии, заключенный между слоями безводного сернокисло- го натрия по 1 см. После прохождения экстракта через колонку проводят удаление коэкстрактивных веществ.

Пример 1а. Колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 2: 1 в количестве 10 мл.

При обнаружении фенбендазола и SNK в ультрафиолетовом свете на

r I пластине обнаруживают коэкстрактивные вещества, которые затрудняют выявление и количественную оценку препаратов.

Пример 1б (оптимальный вариант)..Колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл.

При обнаружении препаратов в ультрафиолетовом свете сиреневые пятна фенбендазола и БМК четко выделяются на зеленом флюоресцирующем фоне пластины.

Пример 1в. Колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:2 в количестве 10 мл.

При обнаружении препаратов в ультрафиолетовом свете на пластине обнаруживают коэкстрактивные вещества, затрудняющие идентификацию препаратов.

Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки

25-30 мм хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку. Хлороформный элюент упаривают до объема

0,2-0,3 мл и наносят на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254.

Рядом с пробой на пластину наносят известные количества фенбендазола и БМК в хлороформе (стандарты).

Пластину помещают в камеру со смесью подвижных растворителей хлороформэтанол (20:1). После прохождения растворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовым светом с длиной волны 254 нм.

При этом фенбендазол и БМК обнару живают в виде темно-сиреневых пятен на зеленом флуоресцирующем фоне плас тины.

1165984 Ь стандартных растворов, используя следующую формулу:

Количество препарата в пробе определяют путем сравнения интенсивности окраски и площади пятен пробы и

А S2 К

Х = — — ——

Я P где Х вЂ” общее количество фенбендаэола и/или БМК, мг/кг

А — количество фенбендазола и/или БМК в стандартном растворе, нанесенном на пластину, мкг;

S, †площа пятна стандартного раствора фенбендазола и/нли

БМК, мм р

S — площадь пятна фенбендазола

1и/или БМК из исследуемой пробы, мм, К вЂ” коэффициент пересчета, учитывающий полноту определения фенбендазола (1,264) и БИК (1,261), P — масса исследуемой пробы, г.

Пример 2. Навеску 10 г мяса, 5 г печени, 5 г жира, 10 г почек .измельчают, помещают в коническую колбу емкостью 100-200 см, заливают 15-20 мл хлороформа или эфира и экстрагируют на аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Затем хлороформный илн эфирный экстракт фильтруют через ватный фильтр в фарфоровую чашку. К пробе повторно добавляют 1015 мл хлороформа или эфира, встряхивают 30 мин и фильтруют через тот же фильтр к первой порции раствориЗ5 теля. Объединенный экстракт упаривают на водяной бане при 60-80 С. Сухой остаток смывают эфиром двукратно порциями по 2-3 мл и наносят на стеклянную колонку с внутренним

40 диаметром 8-9 мм, содержащую 1,5сантиметровый слой окиси алюминия для хроматографии, заключенный между .слоями безводного сернокислого натрия по 1 см, После прохождения экст45 ракта через колонку проводят удаление коэкстрактивных веществ. Для этого колонку промывают смесью эфира и ацетона в соотношении 1:1 в количестве 10 мл. Полученный элюент отбрасывают и препараты вымывают из колонки 25-30 мл хлороформа, который собирают в фарфоровую чашку.

Хлороформный экстракт упаривают .до объема 0,2-0,3 мл и наносят на хроматографическую пластину Силуфол УФ-254. Рядом с пробой на пластину наносят известные количества фенбендазола и БМК (стандарты). Плас7 тину помещают в камеру со смесью подвижных растворителей хлороформ зтанол (20: 1). После прохождения растворителей пластину высушивают на воздухе и облучают ультрафиолетовым

S светом с длиной волны 254 нм. При этом феибендазол и БМК обнаруживают в виде темно-сиреневых пятен на зеленом флуоресцирующем фоне пластины. Флуоресцирующие на пластине пятна фенбендаэола и БИК из стандарных растворов и исследуемой пробы обводят по периметру простым карандашом, пластину опрыскивают свежеприготовленной смесью 2,5Х-ного раствора треххлористого железа в 50Хном водном ацетоне и 0,25Х-ного раствора калия гексацианоферрата- Ш в 50Х-ном водном ацетоне в;соотношешении 3:1-1:5 и выдерживают нри

90-110 С до появления .пятен фенбендаэола.

Пример 2а. Пластину опрыс кивают проявляющим реактивом нри соотношении компонентов 3:1.

Фенбендазол выявляют в виде бледно-голубого пятна на светлом желто-зеленом фоне.

Пример 2б (оптимальный вариант). Пластину опрыскивают про30 являющим реактивом при соотношении компонентов 1:1.

Фенбендазол выявляют в виде интенсивного голубого пятна на свет-. лом желто-зеленом фоне.

Пример 2в. Пластину опрыскивают проявляющим реактивом при соотношении компонентов 1:5.

1165984

l0 редине количества препаратов, онреде ленные после внесения, мкг г анализов. дования

l Г ибеидазол

1 3,5 5,0 10 0 1,0 5 0 10,0

0,44 3,60 7,42 0,84 4,01 7,34

0,40 4,29 8,32 0,79 4,25 8,20

0,46 4,37 8,01 0,71 3 ° 59 8,06

Оэ.32 Зэ40 7 ° 40 Оэ80 4 ° 12 8э37

Мясо

Печень

10.Почки

Объект иссле- Навеска, Количество

Фенбендазол выявляют в виде бледного голубого пятна на светлом желто-зеленом фоне.

Количественную. оценку фенбандаэола проводят, как указано.

В таблице представлены результаты определения количеств фенбендазола и БМК при добавлении их к исследуемым объектам.

Чувствительность предлагаемого способа составляет 0,5 мкг фенбендазола и 1 мкг БМК в нанесенной на пластину пробе или для фенбендазола в мясе и почках 0,05 мг/кг, в печени и жире О, 1 мг/кг; для БМК в мясе и почках 0,1 мг/кг, в печени и жире 0,2 мг/кг.

Процент определения равен для фенбендазола 79,1+2,2; для БМК

79, 3+1, 1.

Предлагаемый способ дает возможность осуществлять контроль за чистотой продуктов животного происхождения после применения фенбендазола и БМК с лечебной и профилактической целью. Он обладает высокой чувствительностью, точностью, специфичностью и позволяет определять одновременно два препарата в органах и тканях животных. Повыпеиие чувствительности предлагаемого способа имеет значение при санитарной оценке продуктов животноводства, так как фенбендазол и БМК на уровнях ниже чувствительности известного способа сохраняются в биологичес- ких объектах длительное время.