Штамм @ @ @ , @ @ -51-продуцент протеолитических ферментов

 

Штамм Bacillus thurinqiensis var.galleriae GFP-51 (хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьшшенных микроорганизмов под номером В-3004) продуцент протеолитических ферментов.

СО03 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (Н) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ ф("

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ", К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ А-, (21) 3745646/28-13 (22) 28.05.84 (46) 30.12.86. Бюл. Р 48 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (72) Ф.П.Галушка, В.А.Говорунова, А.В.Нестеренко, П.В.Бабаева, В.Б.Смирнов и А.Н. Федотов (53) 663.11(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Ф 737442, кл. С 12 N 15/00, 1977.

Авторское свидетельство СССР

У 771159, кл. С 12 N 15/00, 1978. (5И 4 С 12 N 9/54, 15/00//(C 12 N 9/54, (54) ШТАММ BACILLUS THURIN(|IENSIS

VAR.GALLEkIAE GFP-5! — ПРОДУЦЕНТ

ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Штамм Bacillus thurinqiensis . var.galleriae GFP-51 (хранится в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции промьппленных микроорганизмов под номером 3-3004) продуцент протеолитических ферментов.

1 118131

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению нового штамма, используемого для получения протеаз.

Целью изобретения является получение нового штамма Bacillus thurinqiensis var. gal1eriae GFP-51, обладающего высокой протеолитической активностью.

Штамм Вас. thurinqiensis GFP-51 — 10 продуцент протеолитических ферментов выделен из генетически нестабильного штамма Вас. thurinqiensis var. galleriae 26 путем рассева его и отбора морфологически отличающихся колоний.

Штамм GFP-51 отличается от родительского штамма 26 отсутствием плазмидных гономав, обладающих свойством интегрировать с хромосомным геномом клетки, в результате чего полученный штамм GFP-5Ф отличается генетической стабильностью по сравнению с родительским генетическим нестабильным штаммом Вас. thurinqiensis v. galle25 г ае 26, Штамм хранят в споровом состоянии о, в физиологическом растворе при 4 С, а также в лиофилизированном виде.

Полученный штамм Bac. thuriqiensis

v. ga11eriae GFP-51 — продуцент протеолитических ферментов депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИ генетики и селекции промьпиленных микро, организмов, коллекционный номер 35 В-3004.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические 40 признаки.

Вегетативные клетки размером (0,30,6)х(1,5-2) мкм расположены отдельно или небольшими цепочками. Образуют споры, расположенные эксцентрально, споры овальной формы. Перитрих. Акристаллический. Мясо-пептонный агар.

Образует колонии белого цвета. Рост неебильный, наблюдается врастание в агар. Мясо-пептонный бульон. Образует кольцеобразную пленку, наблюдается равномерное помутнение бульона.

Картофельный агар. Рост обильный, сплошной. Цвет колоний белый. Врастания в агар не наблюдается. Сухой питательный агар. Рост обильный, сплошной. Цвет колоний белый с серым оттенком. Форма колоний — неправильная, профиль колонии — изогнутый, 0,05

0,04

6 2 край колонии — волнистый, структура колончи — однородная.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. Грамположительный. Дает хороший рост при 30 :.

Крахмал гидролизует.

Желатину разжижает.

Молоко пептонизирует.

Уреазоотрицательный.

Лецитинаэоотрицательный.

Зскулиноположительный.

Усваивает: глюкозу, лактозу, арабинозу, целлобиоэу. Не усваивает маннит. Нитриты восстанавливает в нитри ты.

Антигенные свойства. Относится к

У серотипу вида Bacillus thurinqiensis

Не продуцирует термостабильного — эк- зотоксина.

Штамм Вас. thurinqiensis ч. galleriae GFP-51 синтезирует протеолитические ферменты. Протеолитическую активность культуральной жидкости определяли по расщеплению азокаэеина.

В табл. 1 приведены сравнительные данные по активности ферментов предлагаемого штамма и ранее известных.

За единицу брали активность фермента, необходимую для расщепления 1 мг азоказеина в течение

60 мин при 30 С. Из табл. 1 видно, что предлагаемый штамм GFP-51 обладает протеолитической активностью, которая в 3 раза вышее, чем у известного продуцента Bac ° subtilis 203.

Культура Вас. thurinqiensis v.

galleriae GFP-51 — продуцента протеолитических ферментов обладает устойчивостью к вирулентным фагам, самопроизвольно фаг не выделяет (см. табл. 2).

Пример. Для приготовления посевного материала используют культуру, выращенную до спорового состояния на питательном агаре. Перед засевом в МИБ для получения инокулята споры прогревают при 75 С 15 мин.

Культуру подращивают в МПБ при

220 об/мин, температуре 30 С в колбах емкостью 750 мг (100 мл питательной среды). Полученную посевную вегетативную культуру используют дпя засева ферментационной среды.

Состав ферментационной среды и условия ферментации при биосинтезе протеазы, 7:

MgS0

lIhlS0„

1181316

Протеолитическая активность ацетонового порошка, определяемая модифицированным методом Ансона, составляет 90-180 ед/г. Синтез экзопротео- литических ферментов осуществляется штаммом GFP-51 стабильно.

Та блица 1

0,23

0,08

1,13

0,001

0,01

0,02

СаС1

К НРО

Кн РО

CuSO

Na-цйтрат (m„) „so

Дрожжи кормовые сухие 2

Кукурузный экстракт 0,5

Соевая мука 0,5 рН среды до 7,2-7,3 доводят 40X NaOH.

Культивирование проводят при температуре 30 С, 220 об/мин в кача- Ытамм лочных колбах емкостью 750 мл со

100 мн питательной среды. Длительность ферментации, т.е. до 95Х высы4 пания спор, 44-48 ч. После окончания ферментации биомассу отделяют от культуральной жидкости центрифугиро- 2 Вac. subtilis, ванием. Из культуральной жидкости методом осаждения ацетоном белков в соотношении 1:2 получают ацетоновый порошок — ферментный препарат.

Протеолитическая активность культуральной жидкости штаммов Вас. subtilis и Вас. thurinqiensi.

Активность протеаз по расщеплению аэоказеина, ед/мл

52,5

203

Вас. thurinqiensis ч. galleriae GFP-51 120+20

Таблица 2

Устойчивость штаммов 26 и GFP-51 Вас. thuringiensis к производственным фагам

Производственные фаги

4 18 25 29 148 Д8 Д4 Д16 Д29 Н К И-77 Э-5 .

GFP-51

Условные обозначения: знак + чувствителен к фагу, — устойчив к фагу.

Составитель В.Голимбет

Редактор О. Кузнецова Техред.П.Сердюкова

Корректор Л. Патай

Заказ 7141/4 Тираж 490.

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, R-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4