Способ получения иммуносорбента

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

„,Я0„„1229204 (5D 4 С 08 В 15 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ВСЕ" 1! -!Ц Ц g

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 1 3 !3!

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3627013/23-05 (22) 29.06.83 (46) 07.05.86. Бюл, 11 17 (71) Ордена Трудового Красного

Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи (72) В.Т. Скворцов и А.Е. Гурвич (53) 661.728,8 (088.8) (56) Лехтцинд Е,В. Синтез новых типов иммуносорбентов на основе целлюлозы. /Канд.дис. -М.: 1982, с. 125-129, (54) (57)СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМИУНОСОР, БЕНТА, включающий обработку пористых целлюлозньцс шариков метапериодатом натрия, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения емкости иммуносорбента., дополнительно

-проводят последовательную обработку избытком 1,5-диаминопентана и N-ацетилгомоцистеинтиолактона в карбонатно-бикарбонатном буфере и избытком

5,5-дитио=оас(2-нитробензойной кисI лоты) и Fab фрагментов антител в трцс =BC P буфере.

12292

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, а именно к способу получения высокоемкого иммуносорбента для специфического связьгвания антигена.

Иммуносорбенты, прецставляющие нерастворимую основу, к которой ковалентной связью присоединяют антитела, нашли широкое применение для специфического выделения как корпускулярных, так и молекулярньгк антигенов (клетки, вирусы, белки, полисахариды, биологически активные пептиды и др.).

Цель изобретения — повышение емкости иммуносорбента.

Пример 1. К 300 мг пористых целлюлозных шариков (ПЦШ) добавляют

ЗО мл 0,1 М т1а10 . Реакционную смесь периодически перемешивают в течение

30 мин при комнатной температуре в темноте. В результате образуются альдегидные группы. IILllll отмывают

500 мл Н 0 на стеклянном фильтре и о, хранят при 4 C . .Количество алт дегид— ных групп практически не снижается по крайней мере в течение двух лет.

300 KI альдегидного производного

IILI!L! промывают на стеклянном фильтре

50 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 9,5 и добавляют 1,5-диаминопентан в избытке до конечной концентрации 0,02 М в объеме 25 мл.

Реакцию проводят в течение 1 ч при комнатной температуре, В конце ðåакции непрореагировавшие альдегидные группы, а также Шиффовы основания восстанавливают 100 мл 0,27.

11аВН! в 0,1 М !!аНСС«.

300 мг ПЦШ промь«воют 50 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера рН 10,6 с 0,00! М этилендиаминтетра— уксусной кислоты и добавляют Е-а.»етилгомоцистеинтиолактон в избытке до конечной концентрации 0,015 М в объеме 15 мл. Реакцию проводят 2,5 при комнатной температуре. Полученное тиолпроизводное ПЦШ промывают 100 мл

О,l М трос — НС!. буфером рН 8,0 с

0,001 М этилендиаминтетрауксусной кислоты и добавляют 10 мл 0,001 .!

5,5-дитио-оос(2-нитробензойнсй кислоты) в избытке в том же буфере. Реакцию проводят в темноте 30 мин при комнатной температуре. Полученное производное ПЦШ отмывают тем же буфером, 0,5 M NaCl буфером и хранят при 4 С. } ab -фрагменты получают из о« 2 истых антител осла против IgG кролиил .

II р и м е р 2. Для получения имму« носорбента берут 3 мг и 1 мг I "ab фрагментов н избытке в О, М трос—

НС1 буфера рН 8,0 с 0,3 М !!аС1 и

0,00! М этилендиаминтетрауксусной кислоты и при комнатной температуре прону=ка от отдельно через дне колонки (0,6 х 14 см),,содержащие по !

2 мг конечного продукта ПЦШ. Вышедший белок пропускают через колонки еще два раза. ПЦШ отмывают тем же буфером и определяют количество связавшегося белка. К ПЦШ в колонках

I--: данных условиях присоединяется

1,.2 мг и 0,57 мг I"аЬ -фрагментов соI стве«<твенно.

Емкость и специфичность получен гых иммуиосорбентов иллюстрируется с «еду«ощим г;римером.

Пример .3. Через колонки с

IНШ1, содержащие 1,2 мг и 0,57 мг

1 aab -фрагментов, пропускают 1 мл и

О, >5 мл нормальной сыворотки кролика. Колонки отмывают О 5 М ИаС1 рН

7,0 до исчезновения белка в промыннсм растворе. Присоединившийся материал элюируют 0,01 П1С1 с 0„5 М

ГгаС и нейтрализуют добавлением сухого . !аНСО . Ре.«ультаты иммунодиффу«ио(-ного анализа элюировапного материала указывают на специфичность с«п-.тезированного иммуносорбевта.

Количество элюированного антигена г : ьроггика! с колонок соответственно состаг«ляет 2„24 мг и 1,5 мг, что соответствует емкости 187 мг/г и !

?5 мг/г иммуносорбента. Однако мо««я !«1П»е с ОО тноон« I ия элюи ров анно ГО

1 антигена п -;.. кролика t и аЬ -фрагментов на иммуносорбентах различают.— ся,0,69 и 0,96«, т.е. в случае

t меньшего содержания Р:Ь -фрагментов на 1ПШ! с антигеном реагирует каждый

«ктги«ный центр !гaЬ . Это объясняется тем,, что большее количество ГаЬ на ПЦ!и создает более плотное распо«II.æåaëå их па ППШ, что приводит к стерическим препятствиям для реакции с антигоном.

При использовании ПЦШ с присое ди:-;енными цельн«»ми молекулами антител емкость составляет 50-60 мг/г (! примерно в три раза меньше чем в примере 3, а соо гношение антиген/активный центр антитела гораздо ни>КР 0 2 "