Способ оценки токсичности водных сред

 

Изобретение относится к водной токсикологии и 1токсикогенетике и позволяет ускорить, упростить и повысить точность контроля за счет оценки мутагенности. Экспонируют двух суточных дафний D тестируемом растворе 24 ч, затем переносят их в чистую воду , где содержат и их потомков до 16-22-суточного возраста. Регистрируют гибель обработанных дафний и пло , довитость выживших особей. При этом учитывают во втором поколении появление индуцированных морфологических, летальных и сублетальных мутаций,оп ределяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, уменьшению плодовитости и продолжительности жизни. Сравнивают показатели гибели обработанных дафний, показатели плодовитости и показатели мутагенности, причем в качестве этих показателей используют их отношение в опыте к контролю, а в качестве показателя мутагенности используют.отношение мутаций в опыте к контролю. 8 табл. с S (Л с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕаЪБЛИК (Зв 4 G 01 и 33/18// С 02 F 3 34

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ., К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2l) 3765741/23-26 (22) 25.06 ° 84 (46) 30,05.86.Бюл. 11 20 (7!)- Научно-.исследовательский институт биологии при Иркутском государственном университете им.А.А.Жданова (72) В.В.Павленко и Т,П.Денисова (53)- 628.356 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 1068083, кл. G 01 N 33/18, 1982.

Строганов Н.С. и Колосова Л.В.

Введение лабораторной культуры и определение плодовитости дафний в ряде поколений. — Методика биологических исследований по водной токсикологии, 1971, с. 210-216. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ВОДНЬЛ СРЕД (57) Изобретение относится к водной токсикологии и токсикогенетике и позволяет ускорить, упростить и повысить точность контроля за счет оценки мутагенности. Экспонируют двух суточных дафний в тестируемом растворе

24 ч, затем переносят их в чистую воду, где содержат и их потомков до

16-22-суточного возраста, Регистрируют гибель обработанных дафний и плодовитость выживших особей. При этом учитывают во втором поколении ноявление индуцированных морфологическнх, летальных и сублетальных мутаций,оп" ределяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, уменьшению плодовитости и продолжительности жизни. Сравнивают IIQ казатели гибели обработанных дафний, показатели плодовитости и показатели мутагенностн, причем в качестве этих показателей используют их отношение в опыте к контролю, а в качестве показателя мутагенности используют отношение мутаций в опыте к контролю.

8 табл.

1234770

Изобретение относится к водной токсикологии и токсикогенетике и может быть испопьэовано при тестировании промышленных и поверхностных сточных вод и химических соединений, S .. загрязняющих окружающую природную среду.

Целью изобретения является ускорение, упрощение и повышение точности способа за счет оценки мутагенности. ®

Способ осуществляют следующим образом.

Двухсуточных дафний F, экспонируют 24 ч в исследуемых растворах и далее содержат их и их потомков Р и !

F,, в чистой воде. За счет этого, для популяций потомков опытных и контрольных вариантов создают одинаковые условия, поэтому можно обнаружить и учесть появление среди дафний второ- 20 го поколения опытных и контрольных вариантов особей с морфологическими изменениями, оценить снижение продол" жительности жизни и изменение пло" довитости. Уменьшение плодовитости у второго поколения опытных вариантов по сравнению с контролем является следствием проявления летальных мутаций, инцуцированных в гаметах родителей F, исследуемыми растворами; 30 появление особей с морфологическими .

"::"=;менениями и снижение продолжительности жизни популяций потомков— следствием проявления индуцированных морфологических .и полулетальных мутаций соответственно, снижающих приспособленность и вызывающих гибель на более ранних стадиях онтогенеза.

При проведении анализа родословных некоторых дафний с морфологическими щ изменениями доказано, что обнаруженные изменения морфологии антенн, антеннул и др. наследуются и, следовательно, являются мутациями, а не модификациями.

4$ (N - пд) 100Х

x„$S (N n o) 1003

"Ь

Э

Пример I. Одновоэрастных дафний — потомков одной партеногенетически размножающейся особи инкубируют до появления у них потомства, затем отбирают двухсуточных особей и используют в опыте, помещая по 10 особей в каждый из аквариумов опыт" ной серии, содержащих по 500 мл растворов Н вЂ” НИМ (N-нитрозо-N-метил.мочевины) в концентрация IOO, 50, 1О, 5,1 и 0,1 мг/л, и контрольной серии с чистой водой. Через 24 ч живых осо- бей переносят в .аквариумы с чистой водой и содержат до 20-суточного возраста. Для слабых токсикантов и слаботоксичньж концентраций время экспонирования увеличивают от 24 до 96 ч, а для высокотоксичных уменьшают от

24 до 6 ч. Двадцатисуточный период наблюдений sa дафниями, начиная с момента их рождения, является оптимальным и достаточным для получения необходимой информации. Кормят дафний ежедневно хлореллой. На каждый из опытных и контрольных вариантов заполняют протоколы, в которых фиксируют необходимые для оценки токсичности сведения о состоянии особей F, . В каждом иэ протоколов указывают количество особей в начале и в конце экспозиции и,.начиная с .6-суточного возраста — наступления половозрелости, ежедневно отмечают количество живых особей Р и количество появившихся о потомков F,.

Появившихся одновоэрастных потомков F, переносят в отдельные аквариумы с чистой водой для получения потомков второго поколения Р . Последних также одновозрастных переносят в отдельные аквариумы с чистой водой. На каждый из аквариумов с особями второго поколения заполняют протоколы, в которых ежесуточно фиксируют сведения, необходимые.для оценки мутаген-. ности: количество живых особей, количество появившихся потомков, количество потомков с морфологическими изменениями. Регистрацию показателей у особей второго поколения прекращают по достижении дафниями 20-суточного возраста.

Для оценки токсичности испытуемых растворов N-НИИ в каждом из опытных вариантов для Р„ рассчитывают процент гибели особей за период экспонирования в растворах,(за 24 ч), где N — количество особей в начале экспозиции; и, — количество особей, выживших к концу экспозиции; процент гибели особей F. за весь период наблюдения где N - количество особей в начале экспозиции э !2

n, - количество живых особей в конце наблюдений (20-суточньж); среднюю плодовитость на одну выжившую условног!лодовитую самку — P, .

Для расчета Р, чисто всех потомков F, появившихся за период с 6 до

20 дней наблюдений (z F ), относят

1 к среднесуточному числу условноплодовитых самок (— --6- — — ) где

-2О

gn6 2 c Ma vHcez a протоколах«ука эывающих количество живых дафний в дни учета с шестых до двадцатых суток, а 15 . — число дней наблюдений за условноплодовитыми особями F

Таким образом, Р рассчитывают по формуле . Г, 15

Р, Ь -7О.

Коэффициенты Б, и К„, рассчитанные для каждого варианта опыта, позволяют количественно оценить степень токсичности разных концентраций агентов по таким показателям как гибель и плодовитость., Коэффициент гибели (Е ) рассчнты0 вают как отношение процента гибели в опытном варианте к проценту гибели в контроле

34770 4 чем в контроле). Гибель за весь период наблюдений увеличивается незначительно И, = I 5-0,37. Но стимуляция . плодовитости в опытных вариантах по сравнению с контролем в 2,5-2,0 раза свидетельствует о неблагоприятном влиянии этих N-HMM на дафний.

Зля высокотоксичных концентраций

N-HMM 100 мг/л и 50 мг/л оценить му1р тагенность нельзя, так как все экспонированные в растворах особи погибают, не оставив потомства.

От особей F,, экспонированных в растворах 10, 5,1 и 0,1 мг/л, полу15 чают соответственно 326, 4!5, 206 и 296 особей F

Для оценки мутагенности испытуемых растоворов N-HMM, в которых экспонируют особей F для второго поколения (Р ) рассчитывают показатели, характеризующие проявление морфологических, летальных и полулетальньж мутаций.

Процент особей с морфологическими

25 изменениями рассчитывают по формуле м. 100Х

М где m — количество особей Г с морЗО фологическими изменениями; количество родившихся и про2 ьналиэированных особей Г, х ц- п х„„

Коэффициент плодовитости (К) рассчитывают как отношение плодовитости особей опытного варианта к плодовитости особей контроля

К Я.=Рл °

P о-к

В табл. I представлены данные о токсичности N-НММ, рассчитанные по. результатам двух повторностей опытных и контрольного вариантов для

D, magna при экспозиции 24 ч.

Концентрации М-HMM 100 мг/л и сО

О мг/л являются остротоксичными для

U,magna! все особи погибают во время .,кспонирования в растворе и 2 = !4,99.

Растворы N-ИММ в концентрациях 0. з„1 и 0Ä1 мг/л обнаруживают сла- .бое специфическое токсичное действие на дафний. Токсические эффекты концентраций IО-О,I мг/л не обнаружены

55 при оценке гибели особей во время экспонирования (лишь в отдельных случаях погибает на 2,5 особей больше, . Процент гибели особей второго поколения за весь период наблюдения (20 сут) рассчитывают по формуле х — — Ег.— Ыг —— (N -n .23 100Ж

Й i где N — количество родившихся осо2 бей F г

n — количество живых особей Р г О

2 в конце наблюдений (20-суточных).

Этот показатель (х ) характеризует

F снижение средней продолжительности жизни анализируемых популяций.

CF "15

Z3

Й

F и

Е (6 201

X F3 — число всех потомков, родившихся за 15 суток наблюдений, от самок второго поколения; где

Средняя плодовитость на одну выжившую условноплодовитую самку за

15-суточный период наблюдений рассчитывают по формуле

1234770 и — сумма чисел в протокоF (б-2о) лах, указывающих количество живых дафний второго поколения (F ) в дни учета

l5 - количество дней наблюдений (количество дней,, в течение которых ведется наблюдение за полово- 1О зрелыми самками: от

6-суточного возраста до

20-суточного). или р = — - 25

И

Мк.

Спонтанный уровень появления морфологических мутантов рассчитывают при анализе выборки около 10000 особей

30 и составляет О,ОООЗЖ, что соответствует 3 10 .

Коэффициент Е рассчитывают как отношение процента гибели особей F в опытном варианте (х ) к проценту

FgсГ гибели в контроле (х )

F..

Xe on

C

2 гк

Коэффициент К< рассчитывают как

2 .40 отношение плодовитости особей F, в опытном варианте (Р„ „ ) к глодо"

Г,о11 витости особей в контроле (Р „ ) Pñ ол

К Я,ф Ф.Л

Рг к 43

В табл. 2 представлены данные о мутагенной активности низких концентраций N-НММ вЂ” известного сулермутагена.

Данные табл.2 свидетельствуют о наличии слабого мутагенного действия испытываемых растворов N-НММ. Уведичивается появление во втором поколении морфологических мутантов на 3 порядка по сравнению со спонтанным уровнем; незначительно (в 1,25 "

2,03 раза) увеличивается гибель и существенно (в 2-4 раза) снижается

Коэффициенты 1, В„ и К рассчй- И танные для каждого варианта 1пыта, позволяют количественно оценить мута". генность разных концентраций агента.

Коэффициент Р рассчитывают как отношение величины появления морфоло- 29 гических мутантов в опытном варианте (М) к спонтанному уровню (8) или к контролю (М )

Моь

1д зз -ь

S плодовитость особей F -опытных вари2 антов по сравнению с контролем.

Таким образом, N-HMM обладает токсичным и мутагенным действием на Daphnia magna Straus. Лимитирующим показателем является мутагенность.

Даже минимальная (O,l мг/л) концентрация индуцирует значительное количество морфологических, полулетальных и летальных мутаций.

Пример .2. Исследуют токсичное и мутагенное действие этилметансульфоната (ЭМС) — известного супермутагеиа, вызывающего мутации замены пар оснований за счет реакций алкилирования и обладающего меньшей токсичностью, чем N-НММ.

В табл. 3 представлены данные, характеризующие токсичность, а в. табл. 4 - мутагенность растворов

ЭМС для Daphnia magna Str.

Концентрации 1000-400 мг/л являют" ся остротоксичными: все экспонированиые особи Р погибают, не оста- ., вив потомства; Е, = 14,99. Концентрации 300-200 мг/л являются среднетоксичными. Они иидуцируют гибель незначительной части от числа обработанных особей, стимулируют их плодовитость. Более низкие концентрации (100, IO, 1 и 0,1 мг/л) обнаруживают специфическое токсичное действие на D.magna;. стимулируют .плодовитость но сравнению с контролем в 1,84—

2,4б раза и не увеличивают гибель.

Концентрации ЭМС 300, 100 10, l и О,l мг/л, обладающие умеренным токсичным действием или не токсичные для D.magna индуцировали морфологические, летальные и полулетальные мутации, которые проявлялись в популяциях потомков (F .), полученных от

2 обработанных особей. Мутагенность выражалась в увеличении процента особей с морфологическими нарушениями на 2-4 порядка по сравнению со спонтанным уровнем; в уменьшении продолжительности жизни (процент гибели в популяции Г увеличивался в l 47—

3,27 раза для концентраций 300, 100 и 10 мг/л и не увеличивался для более низких концентраций); в резком снижении плодовитости.

Таким образом, этилметансульфонат обладает токсичным и мутагенным действием. Лимитирующим показателем яв1234 770 ляется мутагенность. Даже низкие концентрации (1 и 0,1 мг/л) индуцируют у дафний значительное количество морфологических мутантов и летальных мутаций, приводящих к значительному (в 7 — 50 раэ) снижению плодовитости..

Пример 3. Исследуют. токсичное и мутагенное действие неразбавленных и разбавленных (l:1, l:5, l:20 и 1:100) промстоков Байкальского целлюлозно-бумажного комбината, о которых известно, что они обладают умеренным токсичным и слабым мутагенным действием, В табл. 5 представлены данные, характеризующие токсичность неразбавленных промстоков íà Daphnia magna Str., а в табл. 6 мутагениое действие этих промстоков при экспозиции

24 ч.

Неразбавленные и слабораэбавленные промстоки обнаруживают среднее специфическое токсичное действие на дафний: не вызывают гибели обработанных особей, но стимулируют их пло,довитость в 2-2,3 раза по сравнению с контролем.

Неразбавленные и слаборазбавленные промстоки индуцируют у дафний умеренное количество морфологических, летальных и полулетальных мутаций., При раэбавлении промстоков их мутагениость снижается: уменьшается количество выявляемых летальных и полулетальных мутантов. Промстоки, разбавленные в отношении 1:20 и 1:100 незначительно увеличивают (в 1,47

l,41 раза) гибель особей второго поколения.-При разбавлении 1:5 и более плодовитость в опытных вариантах снижается в Г по сравнению с контролем менее чем в 2 раза (К„. = 0,54 — 0,6; табл. 6).

Таким образом, промстоки обнаруживают слабое токсичное и мутагенное действие на Daphnia magna Str. Лимитирующим показателем является мутагенность. Даже разбавленные в 100 раз промстоки способны индуцировать возникновение морфологических мутаций.

Более чем 100-кратное разбавление, вероятно, является биологически безопасным.

30 ботанных самок .(Я,= 0 и К 0,46—

6,58) . .Специфичное действие N-ИММ в кон35 центрации 1 мг/л: при Е = 11,98 (повышение токсичности), плодовитость выживших нормализуется и практически не отличается от контроля (K = 0,86).

Сопоставление показателей позволяет

Ю считать 1 мг/л также слаботоксичным раствором.

Способ оценки токсичности водных

45. сред, включающий экспонирование дафний в тестируемом растворе, регистрацию физиологического состояния и сравнение полученных результатов, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с

50 целью ускорения, упрощения и повыше ния точности способа оценки токсичности сточных вод и химических соединений за счет оценки мутагениости, после экспонирования дафний переносят в чистую воду, где содержат нх и их потомков до:16-22- суточного возраста Регистрируют гибель обработанных дафний и плодовитость выживших осоПример 4. Способ проводят аналогично примеру 1, используя ветвистоусых рачков — Daphnia pulex.

Токсичное действие N-иитроэодиметилмочевины на Daphnia pulex гвед.ставлено в табл.7.

Растворы N-нитрозодиметилмочевины (N-ДИ4) в концентрациях 1000—

50 мг/л являются для D.pulex остротоксичными: 7. = 59,88; в концентрации 30 мг/л N-ДММ обладает средним токсинным действием: Е = 29,94 и

К, = 0,76.

Растворы.Ы-ДММ в концентрациях

10-0,1 ыг/л обнаружили слаботоксичное специфичное действие на D.pulexI. при незначительной гибели, отмечена стимуляция плодовитости BbDKHBIBEé час ти популяции — Z, 0 — 5 99 и К

1,34-1,62.

Токсичное действие 11-нитрозометилмочевины íà Daphnia pulex представлено в табл.8.

Растворы N-HMM в концентрациях

200-50 мг/л являются остротоксичными для D.pulex: все особи погибают в течение экспонирования в растворе, Е„ = 59,88.

Растворы 30-.5 мг/л слаботоксичны: отсутствие погибших особей сопровождается пониженной плодовитостью обраФормула изобретения

1234770

9 бей, учитывают во втором поколении появление индуцировайных морфологических, летальных и сублетальных мутаций, определяемых соответственно по появлению особей с измененной морфологией тела, уменьшению плодовитости и продолжительности жизни, сравнивают показатели гибели обработан-

1О

Т4ВЙ ° )) ° 1

) 00 14,99

100 100 0+0.0 14,99

100 100 100,020,0 100

О 5 2И25 О

lO 5,025,0 0,75

Ь,6

5,76 7,)9+1,4) 2,07

4,00 7,3523,35 2,12 о.о+о,о

0 о . о,о о,о . о

О 5 2,5+2 ° 5 О

)0,7

4,37 6,69+2,32 ),93

2 5225 037

9,0

О О 00+00 20

IO,Oò1Î,0 l,5Î 11 33 5 70 В,5292,В) 2,46

0,1

6,67 . I

3,47 3,47

Таблица2

Мутанты

Концентрация, мг/л морфологические полулетальные (увеличение гибели) летальные (уменьшение плодовитости) T

Р

10.О,31 l,0 lO 12,27 1,75

2,71 0 41

I,76 0,27

1,6 ° I О 14,22

0,48

2,03

3,24 0 49

8,74 1,25

0,00

1 ° IO !2 50 1 78

О,l 0,34

3,27. 0,5

6,59 I

Контроль. 0,00

7,01

Спонтанный уро- О,ОООЭХ

Фень 10 ) 100 )00 100 100

Кок у аь О 0 ОТО 6,67 ных дХфйий, показатели плодовитости и показатели мутагенности, при этом в качестве показателя гибели, плодо« витости используют отношение этих показателей в щтыте к контролю, а в качестве показателя мутагенности используют отношение определяемых мутаций в опыте к контролю.! 234770

Ф о е

Ф Ф о Ф е л Ф а ° а ° м — aal

° .

»Ф

1 1 1 О

1IC

Ф

I С! л

Ф а а и р л а * ф

° ф °! аЧ

0 Л an an

I а а а I о о — о

0а 0 0

0 Е 0 Л а а а

»Ф Ф Ф л 1!!! ! 1, л а о

lI н й4

V y Д О 1 Л g g O

I,е

fa» М

О О О О 1 О .О О О

О О О !б г II!

К CI О О

1 л

I О О О О Ф а

° Ô

О Д о

2 3 а ° а ф

+! +I

О Л

О а

an ю

Ф еЧ в

+I

bc 1 о а

° . а O

Ф - О О О О

1 I! g I I I I о g

1 1

8 3 R e

О О О О О О

8 8 3 ь e e о ь е м а

8 3 $8 3 О

О мах

1 О, 1 О

aI

Ю В а О

В

° н ! а, Jl

51-Õ

О Х I»

Х 4I 0

1 О

aaI Х

О О

О О

* а

О О

О О

+1 +1

О О

О О а а

О. О

Р О

Ю е е а а мс Э

+1 +! о еч и а л О!!!

0 О ф Ф аа.

ЧР а ф

1234770

Таблица 4

Мутанты морфологические полулетальные — уве- летальные — уменьличение гибели кение плодовитости

М % 4

К„

Pf.

15,79 5,2 10

0,08

10,42 1,49

0,54

300

3,7 10

l,49+0,54 0,23

10,33 + 1,47

+10,32

0,11+

+0,1

100

1, 34+0, 59 О, 20

3,2 ° 10

22,89 + 3,27

+ l2 0О

0,971

+0,97

0,795+0,165 0,12

1,4 10

4,57 + 0,65

+ l,88

4,12+

+4,11

1,07

0,12+0,04 0,02

1,4 10

0,1

6 59

Контроль

0,0003% (3 10 ) Таблица 5

Раэбавления х + m промстоков

1 2! 2

0 2,5+2,5

I:0

О 2,5+2,5

О 0,0+0,0

l;5

2,5+?,5

О 0,0+0,0

I:20

0,0+0,0

0,0+0,0

I:IO0

6,67

6,67

Контроль 0

Концентрация, мг/л

Спонтанный уровень

4,2+

+4,2

Х (гибель в и растворе агента),%, при повторности

7,47 +

+ 7,46

7 Ol

Х (гибель F в

Pi о течение наблюдений), %, при повторности .

5,0+5,0

5,0+5,0

2,5+2,5

16. 1234770

Лродолжение табл.5

Р, (плодовитость Г 7,при повторности

Равбав ленив иромстоков х

Д м Х1ла =

6 x8„

Ро оь

К

Р„ к+ш

2,25

4,12

0,75!

0,75

2,29

4,65

I 9l

3,56

0,37

1!5

l,88

2,93

0,31

2,45

9,6 6,03+3,58

1,74!

: 100

Контроль

3,47

3,47

Таблица 6

Разбавления

Мутанты промстоков полулетальные (уве личение гибели) морфологические х,, ж г, Р К

Ъ Ъ

М, Ж

I ° 10 26,87+11,98 3,83

3,17+2,94

31,3+23,67 4,47

1: 1

l 5

6,2 ° 10

15,995+9,225 2,26

l,86+0,52

1: 20

9,0 "10

10,23+2,86 1,47

2,76+2,48

9,895+0,035 1,41

0,52+0,51 1,7 10

I : IOO

7,01 !

Контроль

О,ОООЗЖ (3 !О ) Спонтанный уровень

0,46+0,46 1,5 10

10,9 7,8+3,09

1 1, 2 7 „93+3, 28

9,7 6,63+3,07

10,1 6,52+3,59 летальные (уменьвемие плодовитости) 2,36+2,0 0,36

2,51+1,9 0,38

3,97+3,27 0,60

3,59+2,36 0,54

3,82+2,65 0,58

659 . 1

1234770

Х „(гибель в растворе аген та),Ж

Х „(гибель . в течение наблюдений), Х

Р (плодовитость) Концент .рация,. иг/л

1000

100

700

500

100

100

300

200

100

100

100

50 29,94 2,2

0,76

5,99 3,9

),34

0 4,12

1,42

10, 5,99 4,71

1,62

1,52

Oi1 0

Контроль 0

5,99 4,4) 10!,67

1 1,91 Х (гибель в течение наблюдеi ний), %

Х„(гибель в растворе агента),g

Концент рация, мг/л .

Р (плодовитость) К, 200

59,88

59,88

59,88

100

100

l0O

)00

100

100

100

0

I 34

0,46

10,0 е 0

1,74

0,6

1,7

2,49

0,58

O S6

1,67 l

Контроль

2,91

100 59,88 !

00 59,88

100 59,88

100 59,88

100 59,88

100 59 ° 88

100 59,88

lO 20 11,98

18

Таблица 7

Таблица8