Способ получения пировиноградной кислоты

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН г

1 л

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Пирооииогр.л-то.г/о

/лицгрии, I/þ гл ОE 73 лб /гО /О9

Вргир луллтибироболил иогы ииг f

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИИ (21) 3918629/28-13 (22) 28.06.85 (46) 07.08.86. Бюл. № 29 (71) Институт биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР и Экспери- ментальный завод биохимических препаратов АН ЛатвССР (72) Т.В.Финогенова, P.ß.Карклинь, И.Т.Ермакова, Н.В.Шишканова и И.Ж.Пелцмане (53) 661.733:576.8 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 386989, кл. С 12 D 13/00, 1973.

Agric.Biol.Chem.,1983, 47, 2619.

„„SU„„1249069 А1 (51) 4 С 12 Р 7/40//С 12 R 1:73 (С .12 P 7/40 С 12 R 1:73 (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ путем аэробного куль- тивирования продуцирующих Ее дрожжей Candida Vipn Kytica на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии глицерин, а также источники азота, фосфора, минеральные соли и тиамин, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения выхода продукта, глицерин вносят в начале процесса,а затем поддерживают концентрацию его не ниже 1 г/л путем периодической подпитки в таких количествах,чтобы концентрация непосредственно после внесения не превышала 46 г/л.

1 !2

Изобретение относится к области микробиологического получения органических кислот, в частности пировиноградной кислоты, и может быть использовано в микробиологической, химической, пищевой и медицинской промышленности.

Пирониноградная кислота может служить как исходный материал для производства таких аминокислот, как триптофан, тироэин или алании, а также используется как добавка к продуктам для придания им кислого вкуса.

Целью изобретения является повышение выхода пировиноградной кислоты.

Выход пировиноградной кислоты может быть значительно увеличен путем дискретной подачи глицерина. н среду (периодической подпитки) в процессе культивирования. При таком способе (табл.1) внесения субстрата количество накапливающей,ся н культуральной жидкости кислоты в 1,5 выше, а период ферментациив 1,4 раза короче по сравнению со способом, где то же количество глицерина вносится одноразово н начале культивирования.

Влияние дискретной подачи глицери. на на выход пирувата (Candida VipoYytica 695, культивирование в колбах на качалке J приведено в табл. 1.

При дискретном способе подачи глицерина последний вносят в среду в таких количествах и через такие промежутки времени, чтобы его концентрация непосредственно после внесения .не превышала 46 г/л. Как видно из табл,2, при концентрации глицерина в среде до 46 г/л количество кислоты увеличивается пропорционально количеству субстрата. При содержании же его в среде 50 г/л и выше наблюдается значительное снижение выхода пирониноградной кислоты вследстние ингибирующего влияния высоких концентраций глицерина на дрожжевые клетки.

В процессе культивирования нецелесообразно допускать снижение концентрации глицерина ниже г/л, так как это приводит к полному потребпению субстрата за кброткий промежуТаК времени и приостановке процесса ферментации.

Влияние концентрации глицерина в среде на выход пировиноградной кис49069 2

S0

20

55 лоты у С. (ipo Eytica 695, приведено в табл.2. .Увеличение выхода пировиноградной кислоты и сокращение времени фермента ции при дискретном способе подачи глицерина н среду поясняется примера— ми и табл.1.

По способности к биосинтезу пировиноградной кислоты (табл.3) проверенные штаммы Candida Oipofytica не имеют существенных отличий от штамма, используемого н прототипе, при культивировании их в идентичных условиях (н колбах на качалке в среде с глицерином.

Содержание пировиноградной кислагы в культуральной жидкости дрожжей

Candida Iipo Eytica приведено в табл.3..

Пример 1. Опыт. Дрожжи

Сапй da (ipoEytica 695 (ВКМ вЂ” У-2378) выращивают н течение 2 сут при 2830 С в пробирках па агаризованной минеральной среде Ридер следующего состава, г/л: глицерин 20,

30; NgS0 7Н007; МаС1 05;

Са(ИОз)2 0«4;,КН РО 1,0, К НРО 0,1, агар-агар 25; дрожжевой автолизат

2 мп; микроэлементы (смесь Буркгольцера), мг/л: KI 0,1, В" 0,01;

Hn 2 0,01;Zn+ - 0,01; Cu 0,01; !!о 2 0,01, Ре 0,05; вода бидистил- лированная.

Клетки из одной пробирки смьгвают

5 мл стерильной дистиллированной воды в колбу объемом 750 мл с 50 мл среды следующего состава, г/л: глицерин 20 (NH„) 80 3,0, МАМБО «

«7! О 07; Са(МО) О,"; к!аС 05;

КН Р0 1,0; К НРО 0,1; тиамин

2 мкг/л, микроэлементы по прописи

Буркгольдера, вода бидистиллированная.

Посевной материал выращивают

24 ч на качалке 220 об/и/мин/ при

28-30 С. Колбы в опытных вариантах засевают из расчета 100 мг клеток (по несу сухой биомассы) на 1 л среды того же состава, которая использовалась для выращивания посевного материала, но количество глицерина увеличивают до 60 г/л и его вносят по 20 г/л н .начале, и через 36 и 72 ч культивирования, когда концентрация в среде соотвестненно снижается до 5 и !О г/л. Таким образом, концентрация глицерина сразу после внесения составляет в

3 249069 начале процесса 20 г/л, чер -.

25 г/л, через 72 ч — 30, г/л ?фпг:!,, ю

Культивирование ведут в колбах в на качалке до полного потребления субстрата при рН 3,5-6,0 (поддерживают добавлением 5Х-ного раствора 2

Na0H). Изменение концентрации глице- 2 рина в процессе ферментации от 5 ц до 30 г/л не оказывает влияния на д динамику накопления кислоты (Фиг. 1) .,О к

Через 5 сут культивирования в н среде накапливается 36 4 г/л пиро- и виноградной кислоты, что состав- ляет. 60,77. от потребленного субстрата. л

HocToЯппый ypoBенъ р11 пОддержива т путем нейтрализации 10/ — ным ðañòором NaÎH.

Глицерин вносят .следующим обраом 20 г/л в начале процесса и Io

0, 10, !5, 35 г/л через 12, 23, 6 и 32 ч выращивания, — îãäà его конентрация соответственно снижается о 3,1 5 и 11 г/л. Таким образом, онцентрация глицерина непосредствено после внесения в среду в разные ромежутки времени составляет 20,23, 1,20, 46 г/л.

За 50 ч происходит полное потребение гпицерина и накапливается

51,8 г/л пирувата. Изменение концентрации глицерина oT до 46 г/л не оказывает влияния на динамику накопления кислоты (фиг.2}.

Контроль. Культивирование ведут как в опытном варианте, но 100 г/л глицерина вносят в начале процесса.

Ферментация заканчивается к 72 ч, в среде обнарлкено 38,5 г/л пирови25 нОграднОи кислОты

Таким образом, пр?? дискретной подаче глицерина выход кислоты увеличивается в 1,34 5, а время ферментации сокращается почти в 1,5 pagp за

Пример 3 . Культивирование ведут, как в примере 2, но ОО г/л глицерина вносят следующим образом:

20 г/л в начале ферментации, затем

44 и 36 г/л через 12 и 38 ч культи

35 вирования, когда его концентрация соответственно снижается до 5 и 10 г/л.

После внесения глицерина она составляет 49 г/л после первой и 46 г/л Г

40 после второй добавки.

Последующее культивирование с целью получ ения п иро в ино r рад ной кислоты проводят в ферментере объемом 10 л с 5 л среды, имеющей такой же состав минеральных солей, как и среда для посевного материала. Концентрацию тиамина снижают до 4 мкг/л, О количество глицерина увеличивают до

100 г/л.

Контроль. Выращивание дрожжей ведут как в опытном варианте, но

60 г/л глицерина вносят одноразово в начале культивирования. Субстрат полностью потребляется за 7 сут, за это время накапливается 24,2 г/л пирувата (выход 40,3 7 от потребленного глицерина).

Таким образом, при дискретном внесении глицерина в среду количество образующегося продукта увеличивается в 1,5 раза, а время ферментации сокращается.на 48 ч.

Пример 2. Опыт. Дрожжи

CaIIdida 3ipnEytica 695 (ВКИ Y-2378) выращивают на агаризованной среде как в примере 1 Для приготовления посевного материала используют сре— ду следуюп?его состава, г/л: глицерин 30; (NH4) 804 6 0, Mg S04 7H 0

1,4; NaC!. 0,5; Са(ИОз)г 0,8;

НРО4 ты — удвоенная концентрация (по сравнению со смесью Буркгольдера1, тиамин 6 мкг/л. Посевной материал выращивают в колбах на качалке (220 об/мин)24 ч.

Посевной материал вносят из расчета 0,4-0,5 г/л (по сухому весу) .

Культивирование проводят при 29 С, рН 4,5, концентрации растворенного кислорода 607-от насыщения.

Ферментация заканчивается через

58 ч, выход кислоты составляет

42, 4 г/л (42, 4Х от потребленного субстрата). Так?п? образом, увеличение концентрации глицерина в среде до 49 г/л при дискретной его пода†че на 9,4Е сниж ет выход пкрувата (по сравнению с примером 21 и на 8 ч увеличивает время ферментации.

Таким образом, культивирование дрожжей Candida fipokytica по предлагаемому способу на среде, содержащей в качестве источника углерода непищевое сырье, — глицерин позволяет увеличить накопление пировиноградной кислоты в культуральной жидкости в

4,6-6,1 раза по сравнению с извест-, 1?49069 ным способом и в 1,15-1,2 раза по сравнению со,способом, по которому до настоящего времени был получен лучший выход пировиноградной кислоты — 43,6 г/л,но согласно которому используют в качестве источника углерода пищевое сырье — глюкозу и дефицитную незаменимую аминокислоту— метионин.

Пировиноградная кислота

Способ внесе-.

Количество глицерина. г/л

Длит ел ьность ферментации ч г/л ния

36,4

60,7

120

Одноразовый

40„3! 68

Таблица2

Концентрация глиЦерина, г/л

l г/л

49,2

2,46

51,0

10,3

51,5

23,4

50,8

17,3

39,6

24,2

40,3

Т аб л иц а3

П1таммы

Пировиноградная кислота, г/л

Итаммы Пировиноград ная кислота, г/л

212

8,4

704

9,4

668

8,5

596

6,2

695 10,3

А 14353 8 5

585

10,1

682

6,4

672

9,6

Итамм, используемый по известному способу.

60(20+20+20 ) Дискретный

Кроме того, как видно из предстаE ленного материала, дискретное внесение глицерина в среду в процессе культивирования по сравнению с одноразовым внесением увеличивает также выход пировиноградной кислоты от потребленного субстрата в 1,341,5 раза и сокращает время фермен1о тации в 1,4-1,44 раза.

Таблица ировиноградная кислота

1249069

Пиробииогр. к-та, л

/лицевав, /,7

20 30 Ю Ю бремя купьти5иро5ания, часы

Фиг. г

Составитель Н.Афанасьева

Редактор П.Коссей Техред В.Кадар Корректор Е.Сирохман

Заказ 4202/27 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.Óæãîðîö, ул. Проектная, 4