Способ определения фибринолитической активности

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1255 (51)4 С 12 N 9/68

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К д BTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

-м=ж-©-зо,ка

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3809318/28-14; 3809316/28-14 (22) 05.11.84 (46) 07.09.86 ° Бюл. 11 33 (71) Львовский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) А. В. Гайда, В. А, Монастырский, Ю. В. Магеровский и Т. В. Даныш (53) 612.115.1(088,8) (56) Tamura Y., Otsuko Q., Sane К.

et a). Biochim, et Biophys. Acta, 1978, 525, рр. 194-199. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ путем инкубации субстрата с исследуемым раствором, остановки реакции и фильтрования с последующей спектрофотометрией фильтрата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и упрощения способа, инкубацию проводят при рН 1,8-8,5, а в качестве субстрата используют фибрин, модифицированный и-диазобензолсульфокислотой, с содержанием 20-30Х групп формулы остановку реакции осуществляют раствором едкого натра. ф

1255641

Составитель М. Позняк

Техред Л.Олейник

Редактор Н. Гунько.Корректор И. Эрдейи

Заказ 4787/29 Тираж 490

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Изобретение относится к медицине, в частности к энэимологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и упрощение способа за счет проведения определений при рН 1,8-8,5, остановки реакции раствором щелочи и применения в качестве субстрата измельченного фибрина.

Способ осуществляют следующим образом.

К суспенэии фибрина (субстрата), модифицированного и-диаэобенэолсульфокислотой, с содержанием ?0-307 групп формулы в буферном растворе с рН 1,8-8,5 прибавляют аликвоту исследуемого ферментсодержащего раствора, инкубио руют смесь при 37 С в течение 20120 мин (в зависимости от интенсивности развивающейся окраски), останавливают реакцию, добавляют раствор

0,1 М едкого натра, фильтруют через бумажный или ватный фильтр и определяют оптическую плотность фильтрата при 440 нм, Контролем служит суспензия субстрата, к которой сначала до бавляют раствор едкого натра, а затем аликвоту исследуемого раствора.

За единицу фибринолитической активности принимают то количество фермента (для плазмы — объем плазмы), которое в условиях определения за I ч дает прирост оптической плотности, равный 1.

Пример 1. К суспензии 5 мг субстрата в 1 мл 0,05 М Na-фосфатного буфера, рН 7,4, содержащего

О, 15 М ХаС1, добавляют 0,2 мл раствора очищенного плаэминогена, активированного стрептокинаэой (10000 ед./мг плазминогена), содержащего 10 — 250 мкг фермента. Смесь инкубируют 1 ч при 37 С, затем доо бавляют 3 мл 0,1 М раствора 11аОН и фильтруют через бумажный фильтр °

Удельная активность 3,0 ед./мг.

10 Пример 2. К суспенэии 5 мг субстрата в 1 мл 0,05 М трис-HCl буфера, рН 8,5, содержащего 0,15 М

NaC1, прибавляют 0,2 мл раствора очищенной протеиназы из Thermoacty15 nomyces vu)garis, содержащего 0,5

5 мкг фермента. Смесь инкубируют

?О мин при 37 С, затем добавляют

3 мп 0,1 М раствора NaOH и фильтруют через бумажный фильтр. Удельная активность 1200

Пример 3. К суспензии 5 мг субстрата в 1 мл 0 1 М соляной кислоты, рН 1,8, содержащей 0,15 M

25 NaC3 прибавляют 0,2 мп раствора пепсина, содержащеro 0,01 — 0,05 мкг Фермента. Смесь инкубируют 30 мин при

37 С, затем добавляют 3 мл 0,1 М раствора NaOH и фильтруют через бущо мажный фильтр. Удельная активность

10600 ед./мг.

Предлагаемый способ позволяет определять фибринолитическую активность как очищенных ферментов, так и сложных биологических смесей в широком диапазоне значений рН— от рН 1,8, где активны кислые протеиназы, до рН 8,5, где активны щелочные протеиназы, обладает высокой чувствительностью, так как позволяет определять до 0,005 мкг фермента и по крайней мере вдвое превосходит известный способ по чув..твительности,