Средство для лечения сахарного диабета

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

С ЗЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (1% (111 (511 4 А 6! К 37/26

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Остальное раствор

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Г!О ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Н А STOPGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 338!600/28-14 (22) 10.02.82 (46) 23 ° 09.86. Бюл. !t 35 (71) Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ (72} В. П. Комиссаренко, И . В. Котмиссаренко, А. С. Ефимов, И. С. Турчин и А. Г. Лысенко (53) 616.379,008,64(088.8) (56} Проблемы эндокринологии, 1981, Ф .1, с. 25-30. (54)(57) СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ САХАРНОГО ДИАБЕТА, содержащее кулотуру островковых клеток поджелудочной железы и физиологический раствор, о тл и ч а ю щ е е с я тем, что, с целью сокращения сроков лечения, оно содержит 8-12-дневную культуру островковых кпеток поджелудочной железы новорожденных поросят и дополнительно сыворотку реципиента при следующем соотношении компонентов, мас.й:

8-12-дневная культура островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят 1,34-1,62

Сыворотка реципиента 1 45-2,87

Физиологический

1258415

ЗО

Изобретение относится к медицине и касается средства для лечения сахарного диабета, Цель изобретения — сокращение сроков лечения эа счет подбора необходимого количества гормонально-активных остроковых клеток н специфической их обработки.

Средство содержит 8- 12-дневную культуру островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят и дополнительно сыворотку реципиента при следующем соотношении компонентов, мас.%:

8-12-дневная культура

15 островных клеток поджелудочной железы новорожденных поросят 1,34-1,62

Сыворотка реципиента . 1,45-2,87

Физиологический раствор Остальное

Средство получают следующим образом.

Выделенные в асептических условиях поджелудочные железы новорож25 денных поросят помещают в стерильную колбу с охлажденным до 4 С раствором Хенкса и антибиотиками (1000 ед/мл пенициллина и 1000 мкг/мл стрептомицина). В боксе железы переносят в стерильную чашку Петри и измельчают глазными ножницами на

1 кусочки размером 0,5-1 мм, Перекладывают измельченную ткань в стерильную колбу и промывают раствором 35 о

Хенкса до отхождения промывных вод, После промывания раствор Хенкса сливают, а колбу вносят 3-5 мп рабочего раствора коллагеназы (0,1% в 0,3%ном растворе трипсина). Раствор фер- 40 мента наливают с таким расчетом, чтобы измельченная ткань была покрыта слоем жидкости толщиной в !5-20 мм.

В колбу опускаю стерильный магнит, закрывают стерильной резиновой проб- 45 кой и ставят колбу на магнитную мешалку для перемешивания. Скорость перемешивания должна быть такой, чтобы над магнитом образовалась небольшая воронка, а в колбе не происходило образование пены. Дезагрегацию ткани проводят при температуре

25-27 С. Первую порцию клеток, отделившихся от кусочков ткани через

1 5-20 мин не используют, В дальнейшем через каждые 10 мин производят слив жидкости со взвешенными в ней клетками во флаконе емкостью 250мл с добавлением 50-70 мл среды 199 с 50% сыворотки для инактивации про— теолитических ферментов. К оставшейся ткани вновь добавляют раствор фермента и ставят на магнитную мешалку для ее дальнейшей дезагрегации. Такую процедуру повторяют несколько раз в течение 30-40 мин. По мере заполнения флаконов производят центрифугирование в течение 10 т ин при 600-700 об/мин. По окончании центрифугирования надосадочнуюжидкость сливают, а осадок ресуспендируют в питательной среде, которая состоит из равных объемов среды !

99, О, 5% гидролизата лактальбумина с добавлением 20% бычьей сыворотки и 100 ед/мл пенициллина. Взвесь клеток засевают во флаконы Карреля.

Культивирование проводят при 37 С в течение 8-12 дней (время функциональной активности клеток), после чего начинается их постепенное физиологическое отмирание.

3а 24 ч до пересадки состав питательной среды меняют, Для лучшего приживления трансплантата к равным объемам среды 199 и 0,5% гидролизата лактальбумина добавляют 1,5-3% сыворотки реципиента. Культуру, предназначенную для пересадки, отделяют от поверхности стекла при помощи 0,2%-ного раствора версена, С этой целью в культуральные флаконы вносят несколько миллиметров подоо гретого до 37 С раствора с таким расчетом, чтобы клетки были покрыты слоем жидкости толщиной в 1,52 мм, Затем их помещают в термостат при 37 С на 15-20 мин. В течение этого промежутка времени жидкость

3-4. раза осторожно перемешивают.

Взвесь клеток отмывают от раствора версена питательной средой методом центрифугирования. Для трансплантации берут 50-70 млн, клеток культуры, добавляют 3-5 мл физиологического раствора и 0,045-0,15 мл (1,53%) сыворотки реципиента и вводят больному. Сыворотку реципиента получают эа 24 ч до пересадки культуры

Р-клеток путем забора крови в стерильных условиях (8-10 мл). Затем кровь ставят в холодильник на 2 ч

Р при 4-6 С для отстаивания, После образования сгустка крови последнюю центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, l 2584 l 5

25

35

50

Полученная сыворотка готова к применению.

При цитологическом анализе культур островковых клеток поджелудочной железы новорожденных поросят обнаружено 4 периода их развития: адаптационный (2-24 ч), интенсивного роста (2-7 дней), стабилизации (8-12 дней) и физиологического отмирания (с 13 дня). Длительность этих периодс в зависит от количества посеянных клеток, Наибольшее количество инсулина изучаемая культура выделяет в период стабилизации (8-12 дней). 3а первые 7 сут культура выделяет 6580 мке/мл инсулина, на 8-12 сут.—

110-280 мке/мл инсулина. Начиная с 13 дня количество инсулина прогрессивно уменьшается и на 13-20 день в культуральной среде определяют

30-40 мке/мл инсулина, последний определяют радиоиммунолoгическим методом.

Пример 1, В случае трансплантации культур с низким содержанием ингредиентов (островковых клеток 1,34 мас.%, сыворотки реципиента 1 45 мас.%, остальное — физиологический раствор) недостаточная эффективность способа связана с малым количеством -клеток, сниженной адаптацией культур клеток в организме реципиента.

Больной Я., 43 года. Производят трансплантацию островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят (70 млн.) с содержанием сыворотки 1,34 мас.X. До трансплантации потребность в инсулине составляла

90 ед. в сутки при колебаниях гликемии от 6,1 до 11,3 ммоль/л, Спустя

2 недели после трансплантации на фоне улучшения общего состояния суточная доза инсулина уменьшилась до

76 ед., колебания уровня гликемии в пределах 4,2-6,4 ммоль/л. Относительно удовлетворительное состояние наблюдалось в течение 4-6 мес.

Пример 2. При трансплантации культур с высоким содержанием ингредиентов (островковых клеток

1,62 мас.% сйворотки реципиента

2,87 мас.%, остальное — физиологический раствор) снижение эффективности применения способа обусловлено токсическим влиянием значительных концентраций сыворотки реципиента на -клетки, Больная Б. Производят трансплантацию культур островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят (120 млн) с содержа-. нием сыворотки 2,87 мас.X. До трансплантации суточная потребность в инсулине составляла 46 ед., колебания уровня гликемии 6,1-16.,3 ммоль/л.

В течение 3 мес после проведенной ксенотрансплатации суточная потребность в инсулине уменьшилась до 32 ед, колебания уровня гликемии в пределах 3,6-12,3 ммоль/л, Пример 3. Более благоприятное влияние на течение сахарного диабета отмечено при трансплантации средства с оптимальным содержанием ингредиентов (островковых клеток

1,48 мас:%, сыворотки реципиента

2,16 мас.Х, остальное — физиологический раствор).

Больная К,, 20 лет производят трансплантацию культур островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят (90 млн) с содержанием сыворотки 2,16 мас.X. Перед трансплантацией потребность в инсулине 210 ед. с колебаниями гликемии

4,4-16,3 ммоль/л при крайне лабильном течении заболевания. В течение

6-8 мес после трансплантации потребность в инсулине не снизилась до 76 ед, течение заболевания приобрело стабильный характер.

Сравнительная оценка эффективности предлагаемого и известного способов лечения сахарного диабета посредством трансплантации культуры островковых клеток поджелудочных желез плодов человека и культуры островковых клеток поджелудочных желез новорожденных поросят приведена в таблице.

1258415

Показатели

Способ

Предлагаемый

Известный

Субъективное улучшение общего состояния больного

Через 3 мес. Через 4-6 недель после трансплан- после трансплантации тации

Через 5-6 мес. после трансплантации

Через 2-3 мес, после трансплантации

Стабилизация течения диабета

Через 6-10 дней после трансплантации

Через 40-50 дней после трансплантации

Появление тенденции к снижению дозы экзогенного инсулина

Уменьшение суммарной дозы инсулина

На 50-547, На 40-447.

Через 3-4 мес. после трансплантации

После 8 мес.

Регресс поливейропатий, ангиопатий, нефропатий после трансплантации

Сокращение сроков стационарного лечения.

Продолжительность стационарного лечения

2-3 недели

1-1,5 мес.

Составитель М. Позняк

Редактор С, Патрушева Техред И. Верес Корректор С, Черни

Заказ 5052/4 Тираж 660 Подписйое

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Й IP

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4