Способ хроматографического разделения пептидов

 

Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к хроматографическому разделению и анализу биологически активных веществ . С целью повьшения разрешающей способности метода и улучшения техники безопасности способ хроматографического разделения пептидов осуществляют растворением анализируемой пробы в буферном водном растворе с рН 2,4-3 на основе хлористоацетатного или хлористоцитратного литья, нанесением полученного раствора на колонку стандартного анали- «атора с сульфокатионитом и многоступенчатым элюированием тем же буферным раствором при температуре 60-70 С с последующей детекцией нингидрином при 440 и 570 нм. Разделяющая способность (число фракций с чистотой не менее 90% на одно разделение ) составляет 40-51 для пептидов тималина и 45 для пептидов калмара. 1 табл. сл ОС СП

СОЮЗ СОВЕТСНИХ, СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (59 4 G OIN 30 02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н AST0PGHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3880027/23-04 ..(22) 05.02.85 (46) 23.09.86. Бюл. У 35 (71) Тихоокеанский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии и Институт мозга

Всесоюзного научного центра психического здоровья АМН СССР (72) В.П.Демушкин, Т.А.Малыгина, В.М Зотов, В.Н.Акулин, А.Г.Говоруха, Л.М.Эпштейн и В.И.Климов (53) 543.54 (088.8) (56) Davis J., Schoemaker Н., Chen L. Jamamura Н.I. — High performance liquid chromatography of

pharmacologically active amines апй peptides in biological materials

Life Sci 1982, ч.30, У 2; р.971987;

Voelter 11 °, Bayer Н., Fuchs

Piertiik E. — Preparative highperformance liquid chomatography

of thyrotropin — releasing hormons

analogues, J.Chromatography, 1978, ч.!53, р.433-442.

„.Я0„„1259185 A 1 (54) СПОСОБ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОГО РАЗДЕЛЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение относится к области аналитической химии, в частности к хроматографическому разделению и анализу биологически активных веществ. С целью повышения разрешающей способности метода и улучшения техники безопасности способ хроматографического разделения пептидов осуществляют растворением анализируемой пробы в буферном водном растворе с рН = 2,4-3 на основе хлористоацетатного или хлористоцитратного литья, нанесением полученного раствора на колонку стандартного анали еатора с сульфокатионитом и многоступенчатым элюированием тем же буферным раствором при температуре

60-700C с последующей детекцией нингидрином при 440 и 570 нм. Разделяющая способность (число фракций с чистотой не менее 90Х на одно разделение ) составляет 40-51 для пептидов тималина и 45 для пептидов калмара. 1 табл.

1259185 2

\ кислотой, содержащего 10%, муравьи— ной кислоты (буфер А).50-150 мкл раствора наносят на колонку стандартного анализатора аминокислот с сильным сульфокатионитом (0,6 х х 25 см ), используемым для анализа аминокислот. Все хроматографические операции проводят при 600С. Колонку последовательно прокачивают со ско1О ростью 30 мл/ч в течение 10 мин буфером Б (0,1 М литийацетатный буфер, доведенный до рН 2,4 соляной кислотой и содержащий 1% метилцеллозольва) и в течение 55 мин буфером

В (0,25 М литиевый буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислотой), далее прокачивают через колонку 35 мин буфер Г (0,4 M литиевый буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислотой ), 50 мин буфер Д (1,0 М литиевый буфер, доведенный до рН 3,4 соляной кислотой ) и 50 мин буфер Е (1,5 М литиевый буфер, рН = 7,0).

Буферы Б-E содержат 0,068 моль ацетата лития, соответствующие добавки гидроксида лития до нужной моляр ности и на 1 л — 2 мл 30%-ного раствора полиоксиэтиленгликоль лаурата, 2,5 мл тиодиэтанола и .1 мл феноЗО ла.

Ф

Обнаружение пептидов i.роводят стандартной реакцией с нингидрином в проточном реакторе анализатора

uBiotvomk LC-2000" (скорость подачи нингидрина 20 мл/ч ) с детектированием при 440 и 570 нм. Количественное определение осуществляют с помощью стандартного автоматического интегратора марки С-RlВ Shimadzu.

Изобретение относится к биохимии в частности к хроматографическому разделению и анализу биологически активных веществ.

Цель изобретения — повышение разрешающей способности метода и улучшение техники безопасности.

Способ осуществляется следующим образом.

Препарат, полученный из мозга кальмара, растворяют в 0,18 М литийацетатном или литийцитратном буфере, доведенном до рН 2 соляной кислотой. Буфер содержит 10% муравьиной кислоты (буфер А). Полученный таким образом раствор наносят на колонку стандартного анализатора с сильным сульфокатионитом (0,6 х х.25 см), используемым для анализа аминокислот, Все хроматографические операции проводят при 70оС. Колонку последовательно прокачивают со скоростью 30 мл/ч 10 мин, буфером Б (0,1 М литийацетатный или литийцитратный буфер, доведенный до рН 2,4 соляной кислотой, содержащей 1% метилцеллюлоз тилцеллозольва) и 20 мин буфером В (0,25 М литийацетатный или литийцитратный буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислотой ). Далее про качивают через колонку в течение

35 мин буфер Г (0,4 M литийацетатный, или литийцитратный буфер, доведенный до рН 3,0 соляной кислоты) ь в течение 50 мин буфер Д (1,0 М литийацетатный или литийцитратный буфер, рН 7,0}. Буферы Б-Е содержат

0,068 моль ацетата лития, соответст вующие добавки гидроокиси лития до нужной молярности и на 1 л 2 мл

30%-ного раствора полиоксиэтиленгликольлаурата, 2,5 мл тиодиэтанола и l мл фенола.

Обнаружение пептидов проводят стан- дартной реакцией с нингидрином в проточном реакторе анализатора (скорость подачи нингидрина 20 мл/ч) и детектированием при 440-570 мм длине волны. Количественное определение осуществляют с помощью стандартного автоматического интегратора марки Shimadzu С-R1B.

Пример 1. Около 5 мг сухоro пептидного препарата, полученного из ганглиев кальмара, растворяют в 150 мкл 0,18 М литийацетатного буфера,-доведенного до рН 2 соляной

Разделяющую способность метода оценивают по числу фракций на одно разделение (чистота фракций не менее

90%) .

5 Пример 2. Пептидный препарат, полученный из ганглиев кальмара, подвергают разделению водными солями лития в условиях примера 1 при

70 С. Полученные результаты идентичSO ны результатам, полученным при 60 С.

Пример 3. Разделение тималина проводят в условиях примера 2 при

45 С. Разрешающая способность равна

40.

Пример 4. Разделение тималина проводят в условиях примера 3 при

550С.

Разрешающая способность равна 44.

4 шающей способности способа и улучшения техники безопасности, в качестве буферного раствора используют водный раствор на основе хлористоацетатного или хлористоцитратного лития, а .злюирование проводят при 60-70©С.

) 2591

Пример 5. Разделение тималина проводят в условиях примера 3 при 60 С.

Разрешающая способность равна 51.

Пример 6. Разделение тималина проводят в условиях примера 3 при 70 С. Результаты идентичны результатам,- полученны; при 60 С.

О

Пример 7. Инкубация пептидного материала в присутствии солей IO лития (рн 2,4 ) при 80 С в течение

2,5 ч приводит к деструкции пептидного материала.

Пример 8. Пептидный препарат, полученный из ганглиев кальмара, подвергают разделению в условиях примера 4 с заменой ацетата лития на цитрат лития. Полученный результат идентичен результатам, полученным в условиях примера 4. 20

В таблице представлены сравниI тельные данные по разрешающей способности известного и предлагаемого способов.

Таким образом, предлагае1ый спо- 25 соб обладает большей разрешающей способностью, чем известный,и при его осуществлении не используют токсичные реагенты.

Количество фракций на разделение пептиды ганглиев

Лептиды ти-, малиУсловия на кальмара

Известный способ

Пример I, 45 С

Пример 2, 45 С!

Предлагаемый способ

Пример 3, .

60 C

Пример 4, 30 70 С

Формула изобретения

Пример, 5, 45 С

Способ хроматографического разделения пептидов путем растворения анализируемой пробы в буферном раст35 воре, нанесения полученного раствора на колонку стандартного анализатора с сульфокатионитом, многоступенчатого элюирования тем же буферным раствором при повьппенной температуре с последующей детекцией нингидрином, отличающийся тем, что, с целью повьппения раэре40

Пример 6, 55 С

Пример 7, 60 С

Пример 8, 700С

Составитель В. Шкилькова

Редактор В.Данко Техред А.Кравчук Корректор Т.Колб

Заказ 5116/43 Тирах 778,Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r.узгород, ул. Проектная, 4