Нитроксильные производные нитрозомочевины, проявляющие противоопухолевую и мутагенную активность

 

Нитроксильные производные нитрозомочевины общей формулы : R,(CHj)NR,C(0)N(NO)R, где ;- R,R, R,H, ,, n О (I);, R R, , ,CH,C1, (II); R,R4, R,H, R3 CHjCHjCl, (III); R,R5, R,H, ,CHiCl, (IV); R -R, R,CH3, ,Cl, (V); R,Rg, , ,CH,C1, (VI); НзССНз , Rr-V/N-O, R5 „Хтн WOOC Нзс CHj проявляющие противоопухолевую и муРНз НзС СНз N-0 )-0 СНз НзС СНз тагенную активность. § (Л С 1C ел СО 05 ел

-., СОЮЗ ОООЕТСНИХ =

Д М

КСГ1УЬЛИН

„,SU„, 1259650 А1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И 0THPblTPM

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ (51)5 С .07 С 275/68, А 61 К 31/17

H.АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ н,с сн, к с и, и с сн, N- 0i 9= Х О б н НС СН

Б - МО, Яб=

НО0с нзс

3 проявляющие противоопухолевую и му- тагенную активность. (46) 23.06.90. Бюл. У 23 (21) 3850244/40-23 (22) 27.!2.84 (71) Отделение института химической физики АН СССР (72) Н. М. Эмануэль, В. Д. Сень, В. А. Голубев, Г. Н. Богданов, Л. С. Васильева и Н. П. Коновалова (53) 547.548.07(088. 8) (56) Johnston Т. P., Мсса!еЬ C. S., Ор1 iger P., S., Montgomery J. А.

- J. Med. Chem. 1966, 9(6), 892-911

Патент Франции Ф 2487343, кл. С 07 С 135/00, 1982. (54) НИТРОКСИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ

НИТРОЗОМОЧЕВИНЫ, ПРОЯВЛЮ!ОПТЕ ПРОТИ", ВООПУХОЛЕВУР И МУТАГЕННУИ АКТИВНОСТЬ (57) Нитроксильные производные нитрозомочевины обшей формулы

2 я 2 3" где

К,=R, R,=Í, R3=CH>, n — 0 (I);

R,=R, R,==Н, R =Сн CH Cl, п=2 (III);

1 l2

ИзобрегенИе относится к. новым производным нитрозомочевины, которые могут найти применение в биологии и медицине.

Предлагаемые иитроксильные производные нитрозомочевины общей формулы

R„(CH )„NH C(O)N(N0)R, где R,-2,2»6» »-тетраметил-1-оксил-4пиперидил, или 4-карбокси-2, 2,6,б-тетраметил-!-оксил-. 4пиперидил, или 2,2,5,5-тетраметил-1-оксил-3-пирролидил;

R „— Н или метил, R — метил или 2-хлорэтил; гг=0-2, -могут использоваться как Противоопухолевые средства, химические мутагены и как спиновые метки в биологических исследованиях. Наличие парамагнитных свойств у предлагаемых соединений позволяет, путем применения метода электронного парамагнитного резонанса (ЭПР), упростить контроль

59650 2 исследуемого процесса. Возможность определения локализации парамагнитных препаратов вплоть до клеточного уровня делает эти соединения незаменимыми прй изучении механизма действия веществ, обладающих противо-,. опухолевой или мутагенной активностьеО е

Целью изобретения является полу1Q чение новых химических соединений, обладающих противоопухолевой и/или мутагенной активностью. Соединения могут быть использованы в качестве спиновых меток.

Нитроксильные производные нитрбзомочевины имеют общую формулу

*В.,(СН,)„НК С(О)В(И0)К, где

2» Ь 3»

20 R>=H(» 2 .1»,I 3 СНР гС1» и

R -Е „R — Н, R -СН СИ,C1» и-0 (UI), Соединения (I-IV) обладают парамагнитным центром N — О, который яв —ляет"я составной частью заместителей R -R, 4

Нитроксильные производные нитрозомоченины (I-.-IV) получают обменной реакцией из.,аминорадикалов:

R, (СН,г)„1 ПИг (V1"1-а"е; а) Р„=Rq ° R =Н г 5»

R =Н» п=0) и сукцинимидных эфиров

iN-R — N-нитрозокарбаминоной кисло3 ты (VOJ a»á) Rç=ÑÍ (ЧП a)

R =СН СН С1 (ЧПб) .

Строение полученных соединений одйоэначно подтверждается элементным анализом и методами ЭПР-, ИК-, УФи масс-спектрометрии.

В HK-спектрах нитрозомочевины (I — IV, VI) -в области 3270-3340 см имеется по одной узкой полосе сред" ней интенсивности„ отвечающей валентным колебаниям связи N-Н. Эта полоса отсутствует в спектре соединения (V), где К, =СНэ. Наличие электроотрицательной нитрозогруппы на

4О фрагменте карбамида в спектрах производных (Т,-UI) отражается в виде смещения полосы карбонильной группы в сторону высоких (1690-!730 см ), а полосы амид II (С-N-H) — в сторону низких частот (1520-1540 см ) по сравнению с частотами соответстну& ших полос в Спектрах алкилмочевины (см. табл. 2).

Электронные спектры спиртовых

50 растворов соединений (I-VI) B области 200-800 нм содержат полосы поглощения нитрозоуреидного и нитроксильного хромофорон. В видимой области спектра первому отнечает полоса с центром около 400 нм, которая для соединений (I-Ш,V) частично, а для соединений (IV, VI) полностью перекрывает более слабую полосу поглощения нитрок6ильной группы.

3 l

В УФ-области спектра имеется одна широкая полоса с максимумом около

235 нм, обусловленная наложением поглощений нитрозоуреидной и ннтроксильной групп (см. табл. 2).

Парамагнетизм полученных соединений подтверждается методом ЭПР.

Спектры ЭПР разбарленных растворов (Х-VI) состоят из трех линий равной интенсивности, что типично дпя нитроксильных монорадикалов. Константы сверхтонкого взаимодействия o j нитроэомочевины (I-VI) (см..табл. 2) характерны для нитроксияьных радикалов пиперидинового ряда.

Пример. Получение предлагае мых соединений: 2,2,6,6-тетраметил.-4-(3-метил-3-нитрозоуреидо)пиперидин-1-оксила (I), 2,2,6,6- тетраметнл-4-(З-нитроэо-3-(,2"хлорэтил)уреидо- метил)пиперидин-l-оксила,(П), 2,2,6, б,-тетраметнл-4-(2-(З-нитрозо-3-(2-хлорэтил)уреидо) -зтил)-пиперидин-l— оксила (Ш), 4-карбокси-2,2,6,6-тетраметил-4- (3-ннтрозо-3-(2-хлорзт«л) уредио)пипер«дин-1-оксила (IV), 2,2, 6,6-тетрамети«-4- 1-метил-3-нитрозо-3-(2-хлорэтил)уреидо!пиперидин-1— оксила (V) и 2,2,5,5-тетраметил-3-1 3-нитрозо-3-(2-хлорэтил)-уреидо) пирролидин-1-оксила (VI).

К раствору ll моль сукцинимидного эфира N-нитрозо-N-метил или И-нитрозо-N-(2-хлорэтил}-.карбаминовой кислоты (ЧШа) или (ЧИ1б) в 5 мл сухого диметилформамида при охлаждении до

0 С и перемешиванин добавляют по каплям раствор 10.ммоль соответствующего аминорадикала (ЧП) в 5 мп диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают 30-120 мин при О С н вь!ливают на 100 r толченого льда. Образовавшийся осадок отделяют, промывают водой и сушат., Перекристаллизацию (Е, П,IV ×Ò} проводят из растворителей, указанных в табл. 1. Образующиеся в виде масла вещества (Ш) и (V) экстрагируют эф."ром (Зк20 мл), экстракт сушат Иа 80Ä « хроматографируит на колонке с силикагелем,, элюент-СНС1з—

:-ацетон-СНз OH (10: 1 l } или СНС1з—

-CHyCN (9:1).

Реакцию нитрозокарбамата (ЧШб) с аминокислотой (ЧПг) проводят в присутствии 0,5 ммоль триэтиламина.

Выходы, температуры плавления и . данные по элементному анализу соединений (I-VI) приведены в табл. a, а их спектральные своиства — в табл. 2.

?59650 4

Полученные в параллельных опытах данные биологических испытаний .соединений (I-VI) и ближайшего аналога

1-(2-хлорэтил)-3-циклогексил-l-нитроэомочевины (ЦГНМ) приведены в табл. 3.

Производные (Т- Ч) и ЦГНМ исследованы в виде эмульсий в 103-ном вод- . ном растворе твина -80, а соединение (VI) — s виде раствора в 10Х-иом водном спирте.

Токсичность предлагаемых соединений определяют при однократном введении на белых беспородных мышах по методу Бернса. В качестве харак5 теристики токсичности использована величина дозы, вызывающей гибель

503 .животных, взятых i omaT (LDJ

Результаты испытаний показали, что предлагаемые нитроксилъные .производные (I-VI) в 1,7-5 раза менее токсичны, чем ЦГНМ.

Определение противоопухолевой активности проведено на опухолях мышей — перевиваемых внутрибрюш«нно лейкемиях Ьа Ь-1210 и P-388 и перевнваемой в мозг лейкемии Ь-1210.

Лейкемию Е.а перевивяют внутрибрюшинно взвесью лейкемических кле30 ток в физиологическом растворе. Инокулум содержйт О лейкемических клеток. спытываемые соединения вводят также внутрибрюшинно, причем первое введение осуществляют через

3 ч после перевивки опухоли, а за" тем — ежедневно.

Лейкемию P-388 перевивают внут6 рибрюшинно (10 клеток в 0,2 мл асцитной жидкости). Соединения (Ш, Ч,VI) и ЦГНМ вводят также внутри4О брюшинно, ежедневно, начиная через

1 сут после перевивки опухбли.

Лейкемию 1.-!210 перев«вают внут5 рибрюшинно (10 клеток-в 0,2 мл асцитной жидкости) и в мозг (10 кле-

5 ток в 0,06 мл физиологического раствора) . Испытываемые соединения вводят внутрнбрюш«нно, ежедневно, .начиная через 1 сут после перевивки опухоли.

50 . Схемы лечения для каждого опыта приведены в табл. 3.

В большинстве опытов дозы предлагаемых соединений и доза.15 мг/кг препарата сравнения (ЦГНМ) экви55 .токсичны и составляют 0,3 от LD

Для соединения (VI) применена доза

20 мг/кг, что составляет 0,23 от

650 Ь .контроле соответственно. лак видно иэ табл. Э, бощ.шинство предлагаемых соедийений обладает высокой антилейкемической.активностью, Так, соединения (П-7) в случае лейкемии La по кинетическому критерию X в 3-4 раза эффективнее, чем .ЦГНИ.

Соединения (Ш) и (VI) по своему терапевтическому действию на лейкемию Р-388 близки ЦГНИ, а соединение (7) на этом штамме по показателю,УПЖ в 1„5 раза эффективнее, ч м ЦГНИ, и обеспечивает извлечение 507 животных, взятых в опыт.

Пои перевитой внутрибрюшинно и в мозг лейкемии Ь-1210 эффективность действия соединений (V,VI) при ана-. логичных схемах лечения сравнима с действием ЦГНИ, причем.для (VI) такая эффективность достигается при более низкой относительной дозе (0,23 от 1Рь, чем для ЦГНИ (0,32 от

Таблица

Ни ронснльныв аролэводныв (7-IIX) (Вичнслено, Х.1

Найдено, Х

Нол вам" ларнаа масса

ВруттоРастворитвхпь леренристалливалия

Теилератрре ллаелв" нин,."С

Соедине

ФОРну а

1 с н )и I

21,77 257 31

17,52 319,81

72 . 13333-1335 5 а,- 551 6 6Ц443 221 4

С,НДН О, 51,35 8,23

Щ 31И 0 48,82 7,56

48,3 7,52 17,6

50,1 7,67 17,0

44, 5 6 27 16 2

П 61 115»»117 5 СНС1 -I eacsm

В . 74 65-71 КХ

l6 78 333 84

l6,02 349,79: с н С1и о

50,37 7,85

44е64 6в34

С НР1И О, г,н,р1н, о, И " 69 129-132 HeOH-и О

9 57 несло KX

48в82 7 ° 56 17э52 319э81

48ч0 7е54

45э25 6е75 19в3

М % A аолононнал мроиатогра4нн иа сяликагеле, алвант-СНС1 -.ацетон-HeOH (IO: I I) 3 1259

Критерием противоопухолевой активности на лейкемиях F-388 и Ь-1210 является увеличение средней продолжительности жизни (УПЖ)опытных животных по сравнению с контрольными, выраженное в процентах и вычисляемое

- по формуле

l0O (? -L ) ия - — — ——

Iõ. где Ь, - среднее время жизни живот-, 1О ных в опытной группе;

Ь вЂ” среднее время жизни животных в контрольной группе без введения исследуемыхсоединений. 15

В случае с лейками Ьа применяют кинетический критерий противоопухолевой активности X", который характеризует степень торможения скорости 20 роста опухоли под действием испытуемого соединения:

1- 4,„ / ., .где 9,„ и у„ - удельные скорости роста опухоли в опыте и 25

С,Н С1К„О 45,28 6,91 19,20 291 76

1259650.з. 8

Та..блица 2

ИК-, УФ-., ЭПР- и масс-спектры нитроксильных производиык (I-ЧЕ) Иасс-спектр

m/е (И ) J

257

1,55

3292 N-Н 448 пл

1725 С=О

415

1532 С-Я-Н

397

384 )тл

368 пл

53

8500

233

319,321

I0 9

l,56

3328 N-Н 451 пл

1727 С=О 418

1525 С-N-Н : 399

100

385 пл

370 пл

7700

234

1 °

3318 N-Н 450 пл

1728 CO 418

)0,4 333,335

1528, С-N-Н 399

104

7.4

385 пл

370 пл

8100

IV 3340 . N-Н 41 8

2560 COOH 400

234

)05

349,351

1,50

I 686,.

1722 СйО

386

1732

I523s.1542)" . 372 пл72

Соеди- ИК»спектр группа

ФФ

УФ-спектр

6, л/(коль см

ЭПР-cnex p," а„,, нТ (+О,Ы) 1259б50

У

УФ-спектр . см

Е, л/(моль, см

8300

319,321

1693 . С* 0

37S йл

6950

29I 293

1730 C=O 400

101

1539 С-N-Н 387 пл

371 пл

8000

: я

Для соединения П приведен спектр жидкости, для остяльных веществ спектры в ваэелиновом масле.

«Растворитель - спирт. "Раствор в беизоле, 25 С, концентрация 5 10 моль/л.

Таблина 3

Ю

Результата изучение нротнвоопухолевор активноетн иитроксилыва нронзводпых (I-VI). йвотиме Опухоль

Йротивоопухолевзв активностЪ

Ивето пере»

ВНВХЯ

РазоВах. лоза> иг/кр оличество хнвотньа охенч ,оетв нт/кг

Ий, х выеив" вмх

60 лией оные

I ""5 б 0 о-ь у о в/б 9,0 70

1 в/б 6,0 30 т l5

2.ЗО SSF Ь-ПЮ

О,I

1I 10О . q,sI. ь в 80- gpss La

В/б 6,0 25 О-Ь у 0

0,6

r5o в/б !0,2 25 1-5 ОМ Р-3ЗВ

0,0 в/б 6,0 50 0-Ь б, в/б 6,0 50 0-4 6

XV 150 . q, 3ll L4l

Ч.. 150 C„S> Ь

o,у

В/б 10 ° 2 50 f 5 6 3 ОЗА Г-3SS

Контроль, време внзии, сут

Продолжение табл.2

1 евазэм с

ЗИР-спек асс-maктр, iY. мТ, а/е (И ) (+0в0®) Схема лечеина еутки после перевнэкн ону» холн

1259650!

Продолжение табл. 3!

Киво тиме

Иман лиинл

Неото дерев ивки

Про твв оол уколе вЛ в активность

Токсичностьь» мгlкг. Соединение олнчестао вивотиых вккия

60 дней

BDF, L;-12!0 в/и 7,0

160

50 1-6 т0 20 1 5

Vi 8» в/б BDF, 1.-1210

20 I-S 6

240 в/б 12,4

BDF, Р-388

BDF, 1.-1210 в/и

270

20 I-б

7,0

0,2

ЦЮН 47 в/б

220

6,0 20 0-4

IS 1-5 б в/Ь 8,2 в!б 10,2

15 !"5 !

5 1-6

Ц ГНИ 47

2! 0

7,0

alì

«Соединеннл (1-V) и ЦЮН испьглюали в виде змулъсни s !02.-ном водном растворе таина-80, а соединение (Vi) - s виде раствора в 102-иом водном спирте.

Принлтке в таблице сокравеиил . в/б - аиутрибрююнино, в/и - в мозг.

Составитель А. Андриевский

Редактор В. Иванова . Техред К..Бонкало : Корректор С.Черни

Заказ 2032 Тираж 343 - Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

С,,В! 7,а

BDF, L- t 2 I0

DBA, г-388

BDF, L-!210!!онтроль, време втмзни сут

Pas вал до» мг/ е

Ч л т