Способ определения стероидных гормонов в биологических объектах
Изобретение относится к биохимии , в частности к способам определения стероидных гормонов. Цель изобретения -. повьппение точности, чувствительности , специфичности способа, а также возможность одновременного определения в пробе нескольких стимуляторов роста группы андрогенов. Образцы тканей животных гомогенизируют в смесителе с пятикратным объемом 0,14 М раствора NaCl. Затем в гомогенат добавляют 2,5 объема смеси растворителей: эфир - метилеихлорид
СОЮЗ СаВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУ БЛИН др а G О1 N 33/74
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
И ASTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ!9 (21) 3779162/28-14 (22) 31 07.84 (46) 30.11.86. Бюл. В 44 (72) Л.Ф.Адигамов (53) 616.07(088.8) (56) Ficat P. Arlet J Coxopathies
inchemiques. Rev.Chir.0rthop. 1972.
58, 6, 543-561. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОЙДНЫХ
ГОРМОНОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЬЕКТАХ (57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения стерондных гормонов. Цель изобретения — повышение точности, чувствительности, специфичности способа, а также возможность одновременного
Э определения в пробе нескольких сти- муляторов роста группы андрогеков. .Образцы тканей животных гомогенизируют в смесителе с пятикратным объемом 0,14 М раствора NaC1. Затем в гомогенат добавляют 2,5 объема смеси растворителей: эфир — метиленхлорид (1:1) и встряхивают в течение
I ч. Зкстракцию повторяют равным объемом экстрагента в течение 30мик.
Органическую фазу переносят в колбу, фильтруют через безводный Яв $0 и выпаривают на роторном испарктеле
„.SU„„1273334 А I при 40 С. Концентрированный экстракт растворяют в хлороформе и наносят на колонку силикагеля (200 меш): фракция 9 1-- 18 мл хлороформа (не содержит исследуемые стероиды),фракция Ф 230 мл 0,5Х-ного метанола в хлороформе - содержит малополярные стероиды (метилтестостерон-стероид
l.l.l, l9-нортестостерон - стероид l. 1.5, трекболон-стероид 1. !.6, 4 -андроствдиен-17Рол-3-он-стероид l.!.7, 17о(-метил-5 А-дигидротестостерон — стероид !.1,9), фракция:
ll, 3 — 25 мл 15Х-ного метанола в хлороформе - содержит полярные стеронды (1.1.8 стероид-11 8 -оксиметипте- 3 стостерон, !.1.11 стероид- Д -внд1,4 ростадиен-17ф -оп-3-îí, I.f.!0 сте- И рокд-6Р "оксиметвндростенолон). Определяют малополярные и полярные стерокды. Полученный на конечной стадии очистки сухой остаток растворяют в 96Х-ном этвноле, добавляют реагент: 96%-ном этанол — концентрированкая Н 80 (l:9). Смесь пере4 меаиввют, прогревают, охлаждают и добавляют этвнол. Смесь еще переие- М кивают и измеряют флюоресценцию при 44
-а 520 нм, Р возбуждения 480 нм. ф;!
1 ил, 1 табл. 4:ь
12
Изобретение Относится к биохи. мии, в час" íîñòè к способам определения стероидных гормонов.
Цель изобретения — повыше»ие точ-. ности, чу)зствительности, специфичности способа, а также возможность одновременного определепия н пробе нескОльких стимулятарОв роста Группы андрагенов .
Способ асу1цестгля)от следую)цим образам.
3 — 10 г образца съедобных тканей сельскохозяйственных животных (мь)шц, печени или почек) гамогенизируют в смесителе с пятикратнь)м объемом
0,14 11 раствора 1)аС1. Гомогенат переносят в плоскодонную колбу, добавля<<)т ",, 5 ()е:.- -" с"-(Оси растворителей: эфир-1-><2 1>tt/J, (>:1) и встрнхи-13ают 1 ч в а>.1}1>)1 > е;1 JIT встряхиваktkt JT, 133<<: Тiirl) . ":, -!} Ttr>33 J t)Pkt) T PBTI!>T>321 объемм з.:<}т)>я . »ra в теченп 30 мин.
Орг) 11)ческу)<} фазу (пос.,.<е о Tстаива»11)«";.<>1> <-11 - ". :: > «> <1 r>):1:.. Ъ ) <З ТС аСЬ)}За)<ЗТ
2!Op Q) КОЕ JT>
<>
Бают 331 . )):: т<)»:;; и()2<3,})1)з е}е при 40 С.
Ск»)",: r.: r! r >»rз» *,;; н)<ый: 1;<.трл)> -< р яc 1 ° . в cnTt ; >;)> "1(1)я Е,> I! : 311 ->Я > ., Tr<<" 1><(>)3„ -» УЕ>З ° )FO Л>Э))1< 1> 01 */ З /, )! Ot>J „3>IT(>IT;21) )Jpor)<Здя 1 С(З с><о<)ас-1 } О, /:.,(32/>)ин, > ; ">е(ци}1 1 8 ил л/1<1>)з<)ф<зрма — ие < Одержи 1 и<. ("ле д)>1 мы; с 3 F! ИО)Е» >3,>gqr
01 3,>" »<)ГО JP/TBkto.ttа» ";T:>ро<1 >О<эме :, е>... >1. 1 О)1<еР)Р >! ""; ;»1 ., Л;2< 333>\ <1311 <Р, 3 1»><» -н<зртеста::т< ))(331 — ст(1>оид 1 . ), 5. тре<п>(111(311 - <. j r T><>><1<,, ) . )3 а ° 1 -а><д=, ре><" ) а/11>1. 1:,-. \ /" - С>}Е-. r -О>3 - (»2<-ро<П> . 7 1 1,-/ . 3;rr:J» IJ — "> > - » ЕЕ->11>-1О 1 е> т<><„> с < et)i)t ст< I)<3)t, 2 ) ° 1 . " > <)3 зэк>1ия 3 25 3>3>3 1 3/, - МЕ ". СОГЗ< T!3 ) .3 . Тестостеро)е. 1.>,1, 1 е сте1з<зи/} -Ь -a31/3pocr3:а/»<3; . <1)paT(1Tt<1O 2 (ПОСЛЕ Храня.}ео) }Зяфк)1 н а 1(<З л О> 3)к е C H:31) 1(а Г «) <я ) в ып аp kt)3 Gt(t r B ваl(ууме ЦО миннмаль»ОГО объема и »аносят на пластину флоризила. 1)рименяют флоризил с флюоресцентным индикатором r!pv. /3 = 254»м (ппастины 20х20 см, толщ»яа слоя О, б ми) . Тон13334 2 кослойную хроматографию проводят двукратно в системах растворителей: хлороформ — этанол — бензол (85:5:15) и гексан — дихлорэтанзтилацетат (50;20:20), Локализацию стероидов устанавливают облучением пластины в УФ-свете и по Rf стандартов. Участки слон силикагеля, соответствую» tJTkte исследуемым стероидам, снимают с пластины, переносят в плоскодонные колбочки и элюируют дважды (па 30 мин) 10 мл 9б -ного зтанола на )лагнитной мешалке, Зтанольные растворы после двукратной элюции объединяют, выпаривают досуха и ис— пользуют для количественного определения стероидов флюорометрическим или ГБХ методом, Фракцию 3, полученную после хроматографии.на колонке силикагеля и содержащую поляр))ые стеро))дь), выпаривак)т до минимального объема и наносят lta пластину окиси алюминия (3Tt)33kJe«JTI)т Л1 0 с <Ьл)ооресцентнь)м 9 3 25 индикатором при =- 254 нм, плас- тины 20х20 см, то)щина слоя 0,5 мм). ТСХ проводят двукратно в системах > растворителеи: хлороформ — этилацетат (1." I ) и бензол — зтаиол (9,5: щ ".0,5). 11редлагаемые условия ТСХ на Al С и 3 позволяют эффективно разделить исследуемые пол))рные стероиды. Локализацию стероидов tta пластине определяют и их элюцию проводят как Описано для малополярных стероидов. ,Па))нь)м методом определяют мало»}олярные и полярные стероиды (кроме (3} 1 -андрастадиен-1i P -ол-3"он, который следует определять ГИХ-)яетадам). Полученный »а кo.)ечной стадии Очистки сухой Остаток, соответY)3лое1)1.1е е одному из исследуемых сте})(з)щов, растворяют н 0,3 мл 9б%- . ного =-такала и добавляют 1 5 мл реаге))та: 9б%-3)ый зтанол — концентрированная серная кислота (1:9). Смесь перемешивают, лрагревают 8 мин при r> 80, охз)а))<дают на ледяной бане и r}g добавляют 1 м<л этанола. Смесь тща" >ель»о пере)<е)е)ива)ат и через 20 мин (выдерживают в темноте при комнатной температуре) измеряют флюоресценцию при <} = 520 нмP - =480 нм. Вега сйаи <}. 53 ГЖХ (з;еект}1<311нь)Й захват) метод - количественного измерения. Метод может быть использован для количественного измерения малопаляр12733"4 з ных стероидон. Для получения фторпроиэводных сухой остаток, соответ" стнующий каждому из исследуемых стероидов, растворяют и 0,5 мл бенэола и добавляют 2-3 капли гептафтормасляного ангидрида. Смесь про о гревают 50 мин при 70 и высушивают под струей азота. При фторирова нии от каждого из исследуемых стероидов получают 3- или 17-монофтор производные и 3,17-дигептафторбути .раты. ГЖХ-анализ фторпроизводных стероидов проводят с использование в качестве жидкой фазы ЗЖ OV-1, на несенной на хроматон ))-М)-DHCS, пр меняют стеклянные колонки размером. 1,5 м, температура колонки 200, ис парителя 240, детектора 250 C, ras носитель — азот 40 мл/мин. Типичны результаты I" ÊÕ-av;vre a на примере фторпроиэводных S 4 -андростадиен! (4 -) 7P -ол-3-он приведены на чертеже ГЖХ (электронный захват)-анализ ст роидов позволяет выявить 0,0002 вещества в пробе. ф Суьп4арное содержание биологически Образцы тканей бычков активных стероидов 1 мкг/кг ткани Пример 1, Опыт проведен на откормочных бычках черно-пестрой породы в возрасте одного года, выра1 щенных в условиях промьппленного комплекса. Животные получали корм )вволю. б7Е питательности рациона составляли концентрированные корма .и 337. сенаж. Животным подкожно н область корня уха имплантиронали 1,1 ! 7о -метил- а -андростадиен-) 7P— "ол-3-он (метандростенолои) в дозах 130 и 70 мг эа 1 и 2 мес до забоя. После убоя животных проводили гигиенический анализ мяса и субпродуктов с применением предлагаемого метода определения остаточных коли. честв биологически активных стерои-. дов андростаноного ряда. Аналогичные исследования стероидов проводили в сыворотке крови испытуемых животных, .полученной в разные сроки после имплантации препарата. В биопробах тканей (мясо, печень, жировая ткань) и сыворотки крови выявлены следующие биологически а ""ивные стероиды: 17 -метил-61-анд» ростен-)7ф-oл-3-он, )Ы-метил-5d.-адростан-178 -ол-3-он; I Ъ),-метил- Ь " -андростадиен-бф, 17 -диол-3 f -он, 17о).-метил-h -андростан-)7P-олг)" -3-он. Суммарное их содержание приведено ниже. Печень 13,8 . То же 10,8 Печень 7,4 То же 12,8 0 0 Мьппцы 0,0 То же 4,2 5,3 м II 3,7 0 0 Р и- 1Я Пщщеденные величины биологически активных стероидов группь| андро-. генов в продуктах жинотнонодства, полученных н условиях стимуляции е бычков 130 мг метандростенолона, превышают принятые в нашей стране и за рубежом гигиецические регламенты содержания соединений данной группы. еВместе с тем, при имплантации бычкам метандростенолона н дозе 70 мг остаточные количества биологически активных стероидов в продуктах животноводства были существенно ниже. Пример 2. Баранчикам под30 кожно в область корня уха был имплантнрован меченый препарат н дозе 50 мг. Биопробы тканей и биологических жидкостей были получены через ),2 и 3 мес после имплантации. Кроме того, поставлен допопнительный эксперимент на собаках по введению меченого метандростенолона. В биопробах от животных (печени, мьппц, слизистой кишечника биологищ ческих жидкостей) выявлены следующие биологически активные стероидные соединения группы андрогенов: Я 17 -метил-6 -андростен-)7P-ол-З-он, 1 7а -метил-Ы-андростан-1 7р-ол-3-он, l7aL-метил- Ь "-андростадиен-6/3,1/р-диол-З-îí, 17о -метил-б4-андростен-i )p I 17p-диол-3-он. Суммарное содержание названных стероидов в образцах от баранчиков, у стимулированных в течение месяца, составляли в среднеи 13,4 мкг/кг (печень) 4,6 мкг/кг (мьппцы),, 2,8 мкг/кг (слизистая кишечника). Приведенные величины содержания стеу роидов в печени превышают допустимые уровни содержания биологически актив ных андрогенов в продуктах животно водства. Вместе с тем по сравнению Биопроба Сроки после имплантации Он жено Не обнаружено следов жено 0,40 То же Печень 0,25 0,36 0,28 Почки Ь 12 с приведенными данными остаточные количества стероидов н печени животных, стимулированных в течение 2 и 3 мес были соотнетственно н 1,5и 2 раза ниже. В ткани мьппц через 2-3,мес после имплантации стероиды выявлены не были ° Пример 3. Проведены опыты на 2 кроликах, которым был имплантирован д андростадиен-ол-17Р-он-3 (по 10 мг препарата). -Убой животных проводили через 20 и 40 дней после имплантации. Исследование остаточных количеств препарата проводился в тканях печени, почек, иьппц„ жире, биологических жидкостях. В этих опытах исследовано также влияние препарата на гормональный статус животных. В таблице прнведень» остаточные количества биологически активных стероидов в съедобных тканях животных. Как показано в таблице, остаточные количества биологически активных стероидов выявлены лишь через 20 дней после имплантация. Через 40 1 дней исследуемые соединения в съедобных тканях обнаружены не были. Уровни тестостерона, прогестерона, ll— -оксикортикостерондов, альдостерона, тироксина, инсулина н сыворотке крови до имплантации и через 40 дней после имплантации существенно не отличались. Полученные данные соответствуют гигиеническим требованиям и регламентам.,Формула изобретения Способ определения стероидных гормонов в биологических обьектах, 73334 Ь вклчающий зкстракцию и биохимический анализ стимуляторов роста группы андрогенон, о т л и ч а ю щ н йс я тем, что, с целью повьппения 5 точности чувствительности и специ» фичности способа, а также одновременного анализа в них метилтестосте. рона, 19-нортестостерона, тренболона, р,14 -андрцатадиен-l7P-ол-3-она, 111З-оксиметилМстостерона, 6 -оксиметандростенолона, ь -андростади1,1 ен-11 Р, 17Р-диол-3-она, 178--метил-5g-дигидротестостерона, водный гомогенат биоматериала экстрагируют смесью эфир, метипенхлорид в соотношении 1;,1, экстракт наносят на колонку силикагеля, промывают хлоро-. формом, далее через колонку пропус.кают 0,5К-ный раствор метанола н хлороформе. и собирают фракцию малополярных стероидов, затем колонку элюируют 157-ным раствором метанола в хлороформе и собирают фракцию полярных стероидов, далее фракцию 25 мвлополярйых стероидов разделяют с помощью метода тонкослойной хроматографии на флоризеле, при этом йдентифицируют 19-нортестостерои, тренболон, Р -андростадиен-17 -олЗО -3-он метилтестостерон и 17о -метил- о1-дигндротестостерон, а фракцию полярных стероидов разделяют метрдом тонкослойной хроматографии на окиси алюминия, при этом идентифицируют ll P-оксиметилтестостерон, 3.» 6)-оксиметандростенолон, g -андро1,.1 стадиен-11Р» 1719-диол-3-он, а коли чественное определение каждого нз гормонов проводят флюориметрически или с помощью метода электроннозахватной газожидкостной хроматографии. Составитель А.Скоролод Редактор Т. Иитенко Техред АЯравчук Корректор И.Куска « Заказ 6384/17 Тирам 778 Подписное ВНИИПИ Государственного конитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, %-35, Рауиская наб. ° д. 4/5 Производственно-полигра4нческое предприятие, г. Умгород, .1и. Проектная, 4