Способ получения солей мурамилпептидов

 

Изобретение касается замещенных пептидов, в частности натриевых солей мурамилпептидов: N-ацетил-мурамил-Ъ-аланил-Б-глютамил-(С 1)-L-ала нил-2- (1,2-дипалмитоил-Зп-глицеро-3- -оксифосфорилокси)-этилс1мида (l); N- -аце тил-мурамил-L-аланил-В-глютамил- -(Cot)-алкиловый эфир ( )-(CV)-L- -аланил-2-(I,2-дипальмитош1-5п-глицеро-3-оксифосфорилокс-О-этиламида (и), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине. Для выявления активности ; среди замещенных пептидов были получены новые соли I и II. Синтез ведут из N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты или ее С( алкилового () эфира, который в среде смеси растворителей (СН 01 + ) в присутствии N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью Ь-аланил-2-(1,2- -дипальмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытания I и II показывают , что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известньп Н-ацетил-мурамил-Ь-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-8п-глицеро-3-оксифосфорилокси)-зтенсламид (пирогенность в лТ °С, .составляет 0,48-1,1 против 2). Кроме того, I и II можно использовать против вирусных и бактериальных воз- ,будителей и для профилактики заболеваний . 4 табл. СО ьо со со СЛ О5 СМ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСГ1УБ ЛИК

ВСЕС(1УЗ,,4 Я

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

В%В. 1В У ;"Pg p, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3622707/23-04 (22) 22.07.83 (31) 4527/82 (32) 23.07 ° 82 (33) СН (46) 23.03.87. Бюл. 11 ll (71) Циба-Гейги АГ (СН) (72) Альберт Хартманн, Оскар Вакер, Герхард Башанг и Лайош Торчай (DE) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Шредер Э. Любке К. Нептиды, М.;

Мир, 1967, ч. 1, с. 116.

Европейский патент 0025495, кл. С 07 С 103/52, опублик. 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОЛЕЙ МУРАМИЛПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается замещенных пептидов, в частности натрневых солей мурамилпептидов: И-ацетил-мурамил-L- аланил-Э-глютамил- (С ф) -L ала нил-2-(1, 2-дип алмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси) -этиламида (I ) N-аце тил-мур амил-L-аланил-D-глютамил-(0d.)-алкиловыи эфир (С -С )-(С Р)-?» -аланил-. 2-(1,2-дипальмитоил-зп-глипе, SU„„1299516 А3 (51)4 С 07 К 9/00; А 61 К 37/02 ро-3-оксифосфорилокс- )-этиламида (II), которые обладают антивирусной активностью и могут быть использованы в медицине. Для выявления активности среди эамещенных пептидов были получены новые соли I u II. Синтез ведут из N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты или ee C(d) алкилового (С,-С ) эфира, KQTopbBI в среде смеси растворителей (СН С1 + СН OH) в присутствии N-оксисукцинимида и дициклогексилкарбодиимида конденсируют с натриевой солью L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида при комнатной температуре. Испытания I u II показывают, что они обладают лучшей антивирусной активностью, чем известныйN-ацетил-мурамил-L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-Нп-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этаноламид (пирогенность в ьТ С, .составляет 0,48-1,1 против 2).

Кроме того, I u II можно использовать против вирусных и бактериальных воз:будителей и для профилактики заболеваний. 4 табл.

1299516

Изобретение относится к способу получения солей мурамилпептидов — новых биологических активных соединений, которые могут найти применение в медицине ° 5

Цель изобретения — получение новых производных в ряду мурамилпептидов, обладающих более высокой антивирусной активностью и низкой токсичностью.

1О

П р и и е р 1. 3,60 r(5,66 моль) (Col)-п-бутилового эфира N-ацетилиураиил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, 0,6 моль воды и 0,88 г(7,54ммоль)

N-оксисукцинимида при непрерывном перемешивании растворяют в 20 мл смеси хлороформа и метанола при объемном соотношении 4:1. В смесь вводят 1,6 r (7,54 ммоль) твердого дициклогексилкарбодиимида и по каплям в течение

4 ч при комнатной температуре добавляют раствор 3,7 (4,72 ммоль) натриевой соли L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-глицеро-3-оксифосфорил-окси)-этил-амида в 40 мл хлороформа. Смесь выдерживают 1 ч, упаривают на роторном испарителе, к остатку добавляют

200 мл диоксана, раствор лиофилизуют., Продукт суспендируют в 100 мл хлороформа, добавляют 600 мл эфира уксусной кислоты, смесь при непрерывном перемешивании охлаждают в ледяной бане в течение 1 ч. Нерастворившиеся частичци дициклогексилкарбодиимида отфильтровывают, фильтрат упаривают, Остаток растворяют в 14 мл смеси хлороформа-метанола и воды 70:30:5 (объемное соотношение) и очищают на колонке (диаметр 4,5 см, длина 80 си), заполненную 700 r геля кремневой кис— лоты 60 (Мерк, 70-230 Nem, А$ТМ) в указанной смесирастворителей. Прого,няют 500мл указанной смеси, затем этой же смесью элюируют продукт. собиоая фракции объемом 10 мл N - 133-152и 153236, их раздельно подвергают диофильтрации. Процент основной фракции растворяют в 300 мл бидистиллированной воды, быстро нагревают до 40 С, после охлаждения пентрифугируют, удаляя нерастворивииеся частички дициклогексилмочевины.

Надосадочную жидкость подают в диализатор (Аиикон Корпорейшн, Данвер, Массачуает, 01932 СНА, модель

ЦО2, ультрафильтр РМ, 10176 мм диаметр, инертный, неонный полимер на основе полисульдюна, средняя неличина пор 10 А) и, подвергают диализу при 4 атм техн, против 1,5 л бидистиллированной воды, 0,5 л буферного раствора фосфата-хлорида натрия (по О,1 М, 1:1, рН = 7) и 1,5 л воды полного вымывания хлоридов.

Полученный продукт диализа (70 мл) стерильно фильтруют на фильтре с милипорами (0,2 MKM) и лиофилизируют. ,Получают натриевую соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Сд)-н-бутилэфир-(С7)-L-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-окси-фосфорилокси)-этиламида (3 4 моль Н О)

У z в виде бесцветного порошка в количестве 4,13 r (67 от теории):

1, ) = + 14 + 1 С (С = 0,44; вода);

Bf = 0,37 (хлороформ:метанол:вода = 70 : 30 : 5);

Rf = 0,64 (этиловый эфир уксусной кислоты : н-бутанол-пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6:10)

Рассчитано, : С 54,77; Н 8,94;

М 5,07; P 2,24; Н О 4,71

С Н

Найдено, %: С 54,3; Н 9,1; N 5,6;

Р 2,3 Н,О 4,7, Рассчитано: Na 1,75

С Н,„ О, 11 РБа (1316,59)

Найдено,", Na. 1,57.

Исходный продукт получают следующим образом.

5,5 г (8,1 ммоль) (С)-и-бутил-(С)-бензилэфир-4,6-0-изопропилиден-И-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты растворяют в 60 мл

60 -ной уксусной кислоты и оставляют на ночь при комнатной температуре.

Желтоватый раствор выпаривают приблизительно наполовину на роторном ис-, парителе при 30 С, лиофилизуют, 4,8 г (7,5 ммоль) полученного продукта растворяют в 100 мл смеси диметоксиэтана и воды (9:1), смешивают с 0,8 г катализатора, состоящего из окиси палладия на угле (10 =ный) и в течение 4 ч обрабатывают водородом, катализатор отфильтровывают, Фильтрат упаривают, остаток чистят дважды хроматографией на геле кремневой кислоты 60 (Мерк, 1:200, фракции 10 и 5 мл) в системе хлороформ: метанол: вода 70:30:5.

Фракции, содержашие.продукт, объединяют, упаривают.

Полученный продукт частично представленный в виде натриевой соли

3 12995 (из геля кремневой кислоты) растворяют в 40 мл бидистиллата и пропускают через 50 мл хорошо очищенного ионообменника (Dowex 50w х 8 50/100 меш, форма Н) колонку промывают 100 мл бидистиллата, элюат фильтруют через фильтр с миллипорами 0,2 МкМ и лиофилизуют. Получают 3,7 г (69_#_ от теории) (Cd)-и-О-утиленэфира-N-ацетил-мурамил-L-аланилЭ-глютаминовой 10 кислоты в виде бесцветного порошка, содержащего 0,6 моль воды. 3 +45 + 1 С (С = 1,142, метаЭ нол);

Rf 0,23 (хлороформ:метанол:вода

70:30:5);

Rf 0,40 (Н-бутанол:уксусная кислота:вода 75:7,5:21).

Исходный материал получают следующим образом. 20

4,4 г (11 ммоль) натриевой соли

N-ацетил-4,6-0-изопропилиден-мурамиловой кислоты (2,5 моль, 1 г) суспендируют в 60 мл диметилформамида.

При интенсивном перемешивании последовательно добавляют 4,4 г (11 моль) хлоргидрата (Со0-и-бутиловый эфир-(Сд.)-бензиловый эфир L-аланил-D-глютаминовой кислоты, 2,53 г (22 ммоль

N-оксисукцинимида и 2,5 г (12,1 ммоль)30 дициклогексилкарбодиимида, смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре.

Для переработки суспензии последнюю разбавляют 100 мл этилового эфи- 35 ра уксусной кислоты и после получао сового размешивания при 0 Г отфильтровывают нерастворившиеся частички (дициклогексамочевина, хлорид натрия)

Фильтрат упаривают в вакууме при

30 С, остаток вводят в 400 мл уксусного эфира и экстрагируют биди тиллированной водой (10х50 мл). После сушки органической фазы и упаривания растворителя остается 5,6 r (Cd)-и45

-бутилэфира-(Со )-бензилэфира N-ацетил-4,6,0-изопрополиден-L-аланил-D. -глютаминовой кислоты в виде аморфного порошка (75Х от теории).

/ot(> = +30 + 1 С (С = 0,732; мета- 50 нол);

Rf = 0,87 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,83 (ь -бутанол:уксусная кис«55 лота:вода 75:7,5:21).

Исходный продукт получают следующим образом.

16 4

5,6 г (12,1 ммоль) (Cd)-n-бутилэфир-(ry)-бензилэфира N-третичн. бутилоксикарбонил-L-аланил-В-глютаминовой кислоты растворяют в 20 мл абс. этилэфира уксусной кислоты, при интенсивном перемешивании и исключении попадания влаги по каплям . вводят

50 мл 4,5 н. соляной кислоты в абс. уксусном эфире и смесь оставляют о стоять в течение часа при 0 С. Желтоватый раствор упаривают при комнатной температуре приблизительно до

20 мл, смешивают с 150 мл диоксана и лиофилизируют. Получают 4,75 г (97X от теории) гидрохлорида (CW)-и-бутилэфир-(Сp)-бензилэфир-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла

r.< -), = +19 + 1 С (С = 0,313; метанол);

Rf = 0,58 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5), Rf = 0,56 (этил-эфир уксусной кислоты: и -бутанол:пиридин:вода =

= 42:21:6:10).

Исходный продукт получают следующим образом.

К 8,5 г (25,8 ммоль) гидрохлорида (Сс ) — и-бутилэфир-(Сg)-бензилэфир-D-глютаминовой кислоты и 7,4 r (25,8 ммоль) N-трет.бутилоксикарбонил-L-алании-N-оксисукцинимидэфира растворенных в 150 мл диметилформамида, добавляют 2,6 r (25,7 ммоль) Nметилморфолина и смесь оставляют стоять в течение 20 ч при комнатной температуре, Прозрачный желтый расто вор выпаривают в вакууме при 30 С, полутвердый остаток вводят в 500 мл этилового эфира уксусной кислоты и экстрагируют семь раз безводным сульфатом натрия. Остаток после выпаривания уксусного эфира чистят на

600 r геля кремневой кислоты 60 (Мерк, размер зерна 70-230, меш А$ТМ) в системе хлороформ:метанол = 98:2.

Продукт в фракциях 36-82 собирают и высушивают. Получают (Cd)- -бутилэфир-(СУ)-бензилэфир-N-трет.-бутилоксикарбонил-L-аланин-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла (6 r, 502 от теории). 3 = +7 + 1 С (С = 0,315; диЭ метилформамид); .Rf = 0,73 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 70:8:2);

Rf = 0,75 (n -бутанол:уксусная кислота:вода = 75:7,5:21).

5 12

Исходный продукт получают следующим образом.

К 1!,Or (30 ммоль) (Cd)-и-бутилэфир-(СУ)-бензилэфира И-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты, растворенного в 25 мл абс. этилового эфира уксусной кислоты, добавляют на холоде при постоянном помешивании и исключении попадания влаги 25 мл

4 н.соляной кислоты в абс. этиловом эфире уксусной кислоты и оставляют все это стоять в течение часа. Легколетучие составляющие упаривают при

25 С, масляный остаток вводят в

150 мл абс. диэтилового эфира и смесь упаривают снова (3 мл). Масляный остаток высушивают над натровым асбестом при полувакууме. Получают гидрохлорид (Cd) — и-бутиловый эфир-(C"г)—

-бензилового эфира D-глютаминовой кислоты (8,5 г; 92,4Х от теории). (d.1 = 9 + 1 С (С = 0,646; меЭ танол );

Bf = 0,82 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,68 (этил-эфир уксусной кислоты и-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42 21:21:6:10).

Исходный продукт получают .следующим образом.

20,0 г (64,6 ммоль) (CY)-бензилового эфира Б-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты растворяют в

750 мл абс,тетрагидрофурана, 25,05 г (64,6 ммоль) карбоната цезия (слука, чистый), растворенных в 80 мл воды вводят по каплям и всю смесь улари— вают в вакууме. Остаток растворяют в

200 мл абс.диметилформамида, растворитель упаривают и всю операцию повторяют. Кристаллический остаток, полученный после сушки в высоком вакууме, растворяют в l л абс. диметилформамида и при постоянном перемешивании по каплям вводят 13,3 г (97 ммоль) и -бутилбромида.

Суспензию, полученную после 18-ча сового перемешивания при комнатной температуре, фильтруют, фильтрат упаривают наполовину и после добавления

1 л этилового эфира уксусной кислоты экстрагируют водой (10xl00 мл). Органическую фазу сушат над сульфатом натрия и упаривают, Масляный остаток вводят в 100 мл диэтилового эфира и кристаллизуют благодаря добавке

1800 мл петролейного эфира и выдерж- ке при -10 С. Кристаллическую массу

99516 отсасывают, промывают и высушивают, Получают (Cd.) — и-бутилэфир-.(Сd)-бензилэфир N-трет.-бутилоксикарбонил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных игл (21 г; 89 от теории).

Т„ = 70-71 С; (3 = 20+1 С (С = 1,149, метаЗ нол);

Rf = 0,77 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 30:8:2);

Bf = 0,92 (этил-эфир уксусной кислоты:й.-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6:10).

L-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-.3-оксифосфорилокси)-этиламид, служащий в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

13,25 г (14,9.ммоль) N-трет.-бутилоксикарбонил-L-аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Бг;глицеро-3-оксифосфорилокси)-этил-амид вводят при постоянном перемешивании вводят в 170 мл охлажденного до 0 С смеси из трифторуксусной кислоты и хлористого метилена при соотношении 1:3 (V:V), причем получают прозрачный раствор.

После выдержки в течение 2 1/2 ч при комнатной температуре раствор упаривают на роторном испарителе при 30 С. Полутвердый остаток для удаления избыточной трифторуксусной кислоты смешивают неоднократно каждый раз со 100 мл хлорида метилена и затем выпаривают, 35 После пятикратного перетирания остатка каждый раз со 100 мл абс. диэтилового эфира и отстаивания полученного продукта получают хорошо фильтруемую суспензию. Ее фильтруют .

40 на нутч-фильтре, промывают твердый продукт диэтиловым эфиром, затем дважды каждый раз 100 мл горячего ацетона и сушат в вакууме при 6070 С. Получают 10,9 г L-алании-245 -(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламид в виде бесцветных кристаллов с Т „ = 138-147 С (95,67, от теории). ° (d-1 = +30 + 1 С (С = 1, хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,14 (хлороформ:метанол =

7:3);

Rf. = 0,40 (хлороформ:метанол:вода = 70 30:5).

Полученный таким образом продукт переводят в натриевую соль следующим образом.

7 1299516 s

3,82 г (5 ммоль) L-аланин-2-(1,2- ный раствор упаривают на роторном

-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфо- испарителе до сухого состояния (30 С), рилокси)-этиламида растворяют в Полученный продукт очищают на геле

100 мл смеси хлороформ:метанол = 7:3 кремневой кислоты 60 (Мерк, размер при кратковременном нагревании до 5 зерен 70-230 Меш, ASTM) в системе

35 С. Охлаждают и осторожно добавля- хлороформ:метанол:вода = 70:30:5 ют по каплям 5 мл 1N натрового щело- (5 мл фракций). Фракции содержащие ка. Прозрачный раствор выпаривают продукт, собирают (ДС) . Остаток посприблизительно до 1/З.первоначально- ле выпаривания растворителя растворяго объема и после добавления 200 мл 10 ют в 250 мл дважды дистиллированной диоксана лиофилизируют. Получают нат- воды и очищают аналогично тому, как риевую соль L-алании-2-(1,2-дипальми- это описано в примере 1, путем дитоил-Sn-глиперо-3-оксифосфорилокси)- фильтрации (AMICON-мешалка, тип 402, -этиламида в виде рыхлого порошка ультрафильтр 9.30/76 мм). Раствор, (0,41 г). 15 остающийся в мешалке, фильтруют чеПример 2. 3,5 г (6,9 ммоль) рез фильтр с миллипорами (0,2 МКм) и

-(Cck)-метилового эфира N-ацетил-му- лиофилизируют. Получают натриевую рамил-L-этенил-Э-глутаминовой кисло-, соль N-апетил-мурамил-L-аланил-Dты и 1,2 г N-оксисукцинимида раство- -глютамид-(Cat)-метилэфир-(СP)-1-аларяют в 50 мл смеси, состоящей.из ди- 20 нин-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицерометилформамида, изопропанола и хлоро- -З-оксифосфорилокси)-этил-амида, форма (1:3:6; V:V:V), добавляют 2,96 моль Н О в виде бесцветного по2

2,10 r (10,35 ммоль) дициклогексил- рошка.

20 о карбодиимида и при исключении попада- t l =+11 + 1 С (С = 0,285;

3 ния влаги при помешивании выдерживают25 10 — ная уксусная кислота);

1 ч при комнатной температуре. Cyc- Rf = 0,25 (хлороформ:метанол:вопензию смешивают с 50 мл этилового да = 70:30:5.); эфира уксусной кислоты, 30 мин выдер- Rf = 0,39 (этиловый эфир уксусной живают при перемешивании в ледяной кислоты: п -бутанол-пиридин:уксусная ванне-и затем отфильтровывают нераст->О кислота:вода = 42:21:21:6:10) (в воримые частицы дициклогексилмочеви- кол-ве 3,1 г; 55% от теории) ° ны. Фильтрат упаривают на роторном Исходные соединения получают. слеиспарителе приблизительно до 40 мл, дуюшим образом. в результате добавления 150 абс. ди- 7,7 r (21,2 ммоль) гидрохлорида этилового эфира выпадает сложный 35 (Col)-метилэфира-(CY)-бензилэфира активный эфир (дважды), фильтруют и L-аланил-Р-глютаминовой кислоты и высушивают, в результате получают 8,96 r (23,3 ммоль) натриевой соли эфир с N-окси-сукцинимидом с Rf = N-ацетил-4,6-0-изопропилиден-мурами= 0,43 (хлороформ:метанол:вода = новой кислоты соединяют аналогично

70l30:5) — сырьевой продукт в ко- 40 примеру 1 по методу дициклогексикарличестве 5,1 .г. бодиимид): N-окси-суксинимид, Полу3,43 r (4,4 ммоль) L-алании-2- ченный продукт без дальнейшей очист-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-Ç-окси- ки расщепляют в 100 мл 60 -ной укфосфорилокси)-этиламида суспендируют сусной кислоты. После 5 1/2 ч мешао в 45 мл хлороформа и при 40 C в те- 45 ния при комнатной температуре растчение 5 мин по каплям вводят 0,86 мл вор упаривают, смешивают с водой, (6,1 ммоль) триэтиламина, растворен- вновь упаривают и после добавки . ного в 5 мл хлороформа, при этом по- 100 мл диоксана лиофилизируют. Остадлучают прозрачный раствор. К нему по ток чистят на 60 мл геля кремневой каплям при интенсивном мешанин 0 кислоты в системе хлороформ:метанол: при исключении попадания влаги ..вода 70.30.5 (7 мл фракции), про в течение 5 мин добавляют раствор цесс проводится дважды. указанного активного сложного эфира Фракции, содержание необходимый в 100 мл смеси, состоящей из диметил- продукт, объединяют, растворитель формамида, хлороформа и диоксана 55 упаривают. В остатке (Сс )-метилэфир(1:14:6; V:V:V). (С 7) -бензилэфир N-ацетил-мурамил-LПосле 2 1/2 ч перемешивания при -аланил-D-глютаминовой кислоты в викомнатной температуре несколько мут- де бесцветной пены с Rf = 0,63 хло9 1 2995 роформ:метанол:вода = 70:30:5) в количестве 6,9 r.

6,0 г (10 ммоль) (СЫ)-метилэфир-(Су)-бензилэфир Н-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, ра- 5 створенного в смеси 1,2 диметоксиэтана и воды 95,5 (Ч:V) гидрируют в присутствии 0,6 г катализатора палладий на угле (10 -ный) в течение 1

1/2 ч при нормальном давлении. Ката- t0 лизатор отфильтровывают и фильтрат упаривают при комнатной температуре при повышенном давлении. Остаток чистят на 400 г геля кремневой кислоты

60 в системе хлороформ:метанол:вода= 15 — 70:30:5 (10 мл фракций), как было указано выше.

Фракции, содержащие продукт,, объ— единяют, растворитель упаривают, Остаток в форме соли натрия чистят от 20 солей, как описано в примере 1, на

50 мл Dowex 50 WX 8 (50/100 Меш, форма Н, сильнокислотный катионообменник). Фильтрат пропускают через фильтр с миллипорами (0,45 мкм) и лиофилизируют. Получают (Cd)-метиловый эфир N-ацетил-мурамил-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты (1,27 моль

Н 0) в виде бесцветного порошка с (д.3 = +47 + 1 С (С = 1,249; мета- 30 нол) в количестве 3,1 r (58 от теории).

Rf = О;80 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

БГ = 0,30 (ацетоннитрил:вода = 35

3:1);

= 0,43 (этиловый эфир уксусной кйслоты:уксусная кислота:вода:метанол = 67:10:23:12).

Пример 3, 9,4 г (11,1 ммоль)40 (Col)-трет.-бутилэфира N-auevvrv-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты переводят аналогично примеру 2 в активный эфир и затем, как описано. соединяют с 6.48 г (8,2 ммолв) L- 4>

-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в присутствии триэтиламина. Полученный продукт суспендируют в 250 мл бидистиллата воды и быстро нагревают до >О

37 С, перемешивают 15 мин в ледяной ванне, отфильтровывают нерастворимые частички дициклогексилмочевины и фильтрат подвергают диафильтрации, как описано в примере 1 (AMICON — ме- шалка 402, ультрафильтр РМ 0 30/76 мм

Остающийся в мешалке раствор (120 мл) лиофилизируют и продукт чистят на

16 1О хроматографе на 550 r геля кремневой кислоты 60Ä

Получаемый продукт собирают, смешивают с 200 мл бидистиллированной воды (рН=7), фильтруют в стерильных условиях (0,45 мкм) и лиофилизируют, Получают натриевую соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Cck) †трет-бутилэфир-(Сg)-L-алании †-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-3 †îêñèôîñôîðèëокси)-этил-амида в виде бесцветного порошка, содержащего 3,4 моль воды. (с 3 -- +14 + 1 С (С = 0,817; .10 -ная уксусная кислота);

Rf = 0,29 (хлороформ:метанол:вода = 70:30"5);

Rf = 0,53 (этиловый эфир уксусной кислоты: Л -бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 4 2:21:21:6:IO). Выход натриевой соли 8,39 r 78 от теории, Пептидпроизводное, используемое в качестве исходного продукта, получают следующим образом.

38,3 г (63,5 ммоль) (Со()-трет,—

-бутилэфир-(С9)-бензилэфира N-12-(4-бифенилил)-пропилоксикарбонил)-?-аланил-D-глютаминовой кислоты растворяют в 700 м смеси из трифторэтана и воды = 9:1 (V/V) и в результате добавления по каплям 1,23 н.соляной кислоты в такой же смеси растворителей (1 об, ч. концентрированной соляной кислоты и 9 об. ч. трифторэтанола) значение рН уменьшается до 1,5 (2 1/2 ч, расход 51,66 мл, т,е. 81 от теории).

Светложелтоватый раствор на роторном испарителе в вакууме, создаваемом водоструйным насосом, при 30 С упаривают почти до 100 мл, затем добавляют 200 мл диоксана, смесь высушивают на холоде.

Полутвердый остаток растворяют в

30 мл абс, диэтилового эфира и при

0-5 С при постоянном перемешивании, и продукт осаждают 150 мл петролейного эфира. Выдерживают на холоде (-26 С), декантируют и повторяют эту процедуру дважды. Масляный остаток затем вводят в 100 мл, трет,-бутанола, лиофилизируют и остаток высушивают над натровым асбестом в высоком вакууме, Получают гидрохлорид (C<-трет.-бутилэфира (Сг)-бензилэфира Ь-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде сильно гигроскопичного порошка.

1299516 (8jÝ + хлороформ);

Rf =,60 да = 70:30:5)

Rf = 0,45 лота:вода = 1 от теории).

7 + 1 С (С = 1,630; (хлороформ:метанол:во(и-бутанол:уксусная кис0:1:2:8) 19,25 r (76,57.

К охлажденному до 0 С раствору, состоящему из 65,96 г (0,2 моль) гидрохлорида (Сс()-трет.-бутилэфира-(С )-бензилэфира D-глютаминовой кислоты и 65,47 г (0,2 моль) N†- (? (4-бифенилил)-пропилокси-карбонил J-Ь-аланина в 650 мл абс. диметилформамида, добавляют при постоянном помешивании 22 мл (0,24-моль) Б-метилформалина и затем 59,11 r (0,24 моль)

2-этокси-М-этокси-карбонил-1,2-дигид, рохинолина. После 10-часового размешивания при комнатной температуре желтый раствор упаривают на роторном испарителе при 30 С. Остаток вводят в 1 л этилового эфира уксусной кислоты, экстрагируют водой (5x200 мл), водную фазу экстрагируют 0,5 л уксусного -эфира и собранные органические

Лазы высушивают.

Продукт, полученный после упаривания растворителя (продукта 150 мл) чистят многократно на хроматографе на геле кремневой кислоты 60 (1:20) с уксусным эфиром. Получают (СЫ)-трет.-бутилэфир-(С P)-бензилэфир-N-(2-(4-бифенилил)-пропилоксикарбонил-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты в виде бесцветного масла. () = -14 + 1ОС (С = 1,625; этиЭ ловый эфир уксусной кислоты) (100 r, 832 от теории);

Rf = 0,73 (хлороформ:изопропанол:

:уксусная кислота = 70:8:2);

Rf = 0,51 (толуол:уксусный эфир

° 1)

Используемый в качестве исходного продукта гидрохлорид (Cd)-трет.-бутилэфира-(СУ)-бензилэфира D-глютаминовой кислоты получают путем проведения реакции между (С )-бензиловым эфиром D-глютаминовой кислоты и изобутанолом в смеси, состоящей из 1 4-диоксана и серной кислоты, выделяют продукт в виде бесцветных игл с Т„ — 108-109 С. (а3 = -16 + 1ФС (C = 1,235; этанол

Rf = 0,84 (хлороформ-метанол:вода = 70:30:5);

12

R f = О, 64 (этиловый эфир уксусной кислоты:4-бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода = 42:21:21:6 .10) в количестве 613 от теории).

5 Пример 4. К раствору 4,62 r (6,05 ммоль) ?,-алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в 100 м смеси хлороформ:

:изопропанол:вода = 70:30:2 при помешивании при 15- С в течение 10 мин по каплям добавляют 14,52 г (7,26 ммоль) 0,5 М раствора триэтиламина в смеси хлороформ:изопропанол:

:вода = 70:90:2. Затем в течение

15 20 мин добавляют 4-мя порциями по

1,5 г в твердом виде 6 0 г (7,26 ммоль) (Со )-метилэфир-(СУ)-N-гидрооксисуксинимидэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глю- таминовой кислоты, содержащий еще дициклогексилмочевину, причем раствор мутнеет на глазах.

Затем после 15-минутного помешивания при 15 С охлаждение прекращают и продолжают перемешивание еще 2

1/2 ч при комнатной температуре. 3атем полученный таким образом мутный раствор упаривают в вакууме при 30 С.

Остаток (10,75 г) суспендируют в

170 мл бидистиллированной воды (рН = 5,5), суспензию путем добавки

0,3 мл триэтиламина доводят до рН вЂ” 6,0; отфильтровывают нерастворимые частицы (дициклогексилмочевины) и

35 фильтрат лиофилизируют в высоком вакууме.

Полученный таким образом лиофилизат растворяют в 300 мл, затем лио40 филизируют в глубоком вакууме.

Получают натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютамил-(Cd)-метилэфир-(Сф)-L-аланин-2-(1,2-дипалмитоил- п-глицеро-З-ок45 сифосфорилокси)-этиламида в виде бесцветного порошка, содержащего

1,90 моль воды. о о = 3,7 + 0,1 С (С = 0,672; хлороформ); (d j = +1,7 + 0,1 С (С = 1,044; вода);

Rf = 0,42 (хлороформ.метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,62 (уксусный эфир:и-бута55 нол:пиридин:уксусная кислота:вода =

42:21:21:6:10) в количестве 5,64 r (71,27 от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

6 14 таминовой кислоты (0,68 моль волы) в

2О виде бесцветного лиоАилизата с Г<1>

= +14,9 + 0,1 С (С = 1,067; метанол), в количестве 11,0 г(96% от теории).

Rf = 0,78 (хлороформ:метанол:вода= — 7,:30:5);

Rf = 0,57 (уксусный эфир. п бутанол:пиридин:уксусная кислота:вода =

= 42:21:21:6;10).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 20,7 r (32,46 ммоль) (Cd)-метилэфир-(СУ)-бензилэфира 4,6-0-изопропиллиден-N-пронионил-дезметилмурамил-Т-аланил-D-глютаминовой кислоты в 400 мл 60%-ной уксусной кислоте мешают в течение 21 ч при комнатной температуре, затем упаривают в вакууме при 30 С и полученный остаток последовательно трижды смеши1 вают каждый раз со .)00 мл воды и снова упаривают. Полученный сырой

1 родукт очищают путем хроматографии на колонне на 1000 r геля кремневой кислоты 60 (Мерк, 0,063-0,200 мм) в системе метиленхлорид:метанол = 85:

:15 (15 мл фракции). Фракции 207-290 собираются и выпариваются в вакууме при 30 С. Получают (Cd)-метилэфир-(CY)-бензилэфир Н-пропионил-дезметилмурамил-Т-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащей 0,24 моль воды (к1 = +16 + 0,1 С (С = 1,463;

Э метанол);

Rf = 0,24 (хлороформ:метанол =

= 9:1);

Rf = 0,55 (хлороформ:метанол =

5:1);

Rf = 0,94 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5) в количестве 13,7 r . (70,1% от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

В суспензию из 13,2 г (35,77 ммоль) натриевой соли 4 б-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 200 мл диметилформамида добавляют при комнатной температуре при мешании 9,6 г (46,5 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, 5,35 r (46,5 ммоль) N-оксисукцинимида и

12,8 r (35,77 ммоль) гидрохлорида (Cd)-метилзфир-(СУ)-бензилэфира Т-алании-D-глютаминовой кислоты и все мешают в течение 21.ч при комнатной температуре.

Полученную таким образом белую суспензию смешивают с 200 мл уксус13 12995)

5,12 г (10,1 ммоль) g -метилового эфира N-пропионилдезметилмурамил-Т-аланил -D-глютаминовой кислоты полностью растворяют в 100 мл смеси хлороформ:изопропанол = 7:3 и в результате добавления 10 мл диметилформамида.

К этому раствору добавляют 2,68 г (13 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 1,50 r (13 ммоль) N-оксисукциними10 да и полученный в результате этого прозрачный бесцветный раствор мешают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре и затем выдерживают 17 ч о 15 при 4 С.

Полученную таким образом суспен эию смешивают с 400 мл диэтилового эфира и затем перемешивают еще в течение 1 ч при комнатной температу20

PB °

Затем кристаллизат отсасывают, промывают диэтиловым эфиром и высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора.

Получают сырой (Сд)-метилэфир -4СУ)-N-оксисукцинимидэфир-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащий в виде примеси дициклогексилмочевину и используемый без последуюшей очистки.

Rf = 0,46 (хлороформ:метанол =

5 ° 1 ) °

Rt = 0 72 (хлороформ. метанол =

Э

7:3) Выход сложного эфира 8,34 r, Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 13,0 r (21,75 ммоль) (Cd)-метилэфир-(Cy)-бенэилэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в 250 мл смеси диметоксиэтан:вода = 20:1 гидрируется

2,5 г катализатора палладий на угле (10%-ный) в течение 1 ч при комнатной температуре и нормальном давлении.

Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме до сухого состояния и полученный остаток трижды смешивают с водой в количестве по 50 мл и снова упаривают.

Осадок растворяют в приблизительно 100 мл бидистиллированной воды, фильтруют этот раствор через фильтр с миллипорами (МАТ GENES: 0,2 мкм) и лиофилизируют в глубоком вакууме.

Получают Ы -метиловый эфир N-пропио- нил-дезметилмурамил-Т вЂ” аланил-D-глю

l5 12995 ного эфира, перемешивают в течение

1 ч при 0 С, отделяют от кристаллиза1 тора (дициклогексилмочевины), на нутч-фильтре, промывают ледяным уксусным эфиром и фильтрат упаривают в о вакууме при 30 С. Полученный таким образом остаток вводят в 300 мл уксусного эфира и дважды последовательно промывают 50 мл 2 н. лимонной кислоты, водой, 10Х-ным раствором гидро- 10 карбоната натрия и снова водой.

Зфирные слои объединяют, высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и упаривают в вакууме.

Получают (Cdá-метилэфир-(C g)-бен- 15 эилэфир 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил;Р-глютаминовой кислоты.

Rf = 0,65 (хлороформ:метанол =

9:1); 20

Rf = 0,86 (хлороформ:метанол =

= 5:1) в количестве 21,3 r (93,3Х от теории).

Оба исходных продукта получают следующим образом.

К раствору 20,3 r (48,0 ммоль) (Сd)-метилэфир-(С )-бензилэфира N -трет.-бутилоксикарбонила-L-аланил-.

-D-глютаминовой кислоты в 100 мл абсолютного уксусного эфира добавляют 30 при 0 С 100 мл приблизительно 5 N соляной кислоты в абсолютном эфире и мешают 2 ч при 0 С, Желтоватыи раствор упаривают в вакууме, полученный остаток дважды сме- 35 шивают каждый раз со 100 мл абсолютного эфира и снова упаривают. После дигерирования с абсолютным диэтиловым эфиром (2x100 мл) остаток высушивают в вакууме и получают гидрохлорид (Cd)-метилэфир-(Сф)-бензилэфира L-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащий 0,31 моль воды. с 3 = +18,6 + 0,1 С (С = 0,043; метанол);

Rf = 0,72 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,44 (хлороформ:метанол

= 5:1);

Rf = 0 31 (хлороформ:метанол =

= 9:1) в количестве 1,7 г (94,8Х от теории).

Раствор 34,4 r (73,8 ммоль, 2,14 ммоль), содержащий хлорид натрия натриевой соли 1 < -О-бензил-4,6-0-иэопропилиден N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 340 мл воды, гидрируют при постоянном значении

l6 l6 рН = 7,1 6,0 r 10K-ного катализатора палладий на угле в течение 23 ч при комнатной температуре и нормальном давлении. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме при 30 С и при рН = 7,1; и полученный таким образом остаток высушивают в высоком вакууме над пятиокисью фосфора. Получают натриевую соль

4,6-0-изопропилиден-Н-пропионил-дезметилмураминовой кислоты (16,6 r, 94,8Х от теории)

Rf = 0,50 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);.

Rf = 0,66 (ацетонитрил. вода =

= 3:1).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 14,3 г (32,7 ммоль) мети-. лового эфира 1 d- -О-бензил-4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в 130 мл метанола смешивают с 24,4 мл (48,7 ммоль) 2 н. натрового щелока и перемешивают в течение 1 1/2 ч при комнатной температуре.

Затем полученный таким образом прозрачный желтоватый раствор с помощью 1 н. соляной кислоты доводят до значения рН = 7,0 и упаривают в вакууме при 30 С.

После сушки над пятиокисью фосфо.ра получают натриевую соль 1 -0.†.бензил-4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов в количестве

27,2 г.

Rf = 0,67 (хлороформ .метанол:вода = 70:30:5);

Rf 0,74 (ацетонитрил:вода 3:1).

Исходный продукт получают следующим образом.

К суспензии из 6,75 r (224,7 ммоль) гидрида натрия в 120 мл абсолютного тетрагидрофурана добавляют по каплям о при 5 С в атмосфере азота при постоянном помешивании в течение 5 мин раствор 31 3 г (85,65 ммоль) 10=0-бензил-2-дезокси-4,6-0-изопропилиден- 2-пропионамид-3-D-глюкопиранозида в 200 мл абсолютного тетрагидрофурана, причем температура повышается до 20 С.

Полученную таким образом суспензию перемешивают erne 2 ч при 40 С, затем охлаждают до О и добавляют по каплям в атмосфере азота и непрерывном помешивании в течение 30 мин

12995!6 17 к охлажденному до -15 C раствору

20,7 r (135,77 ммоль) метилового эфира бромуксусной кислоты в 95 мл абс. тетрагидрофурана. Полученную таким образом суспензию размешивают еще в течение 3 ч при 0-5 С, затем добавляо ется 20 мл метанола и 20 мл тетрагидрофурана. С помощью 4,5 мл ледяной уксусной кислоты устанавливан т значение рН-6 и раствор упаривают в вакууме при 30 С.

Остаток растворяют 200 мл метиленхлорида и промывают полученный раствор водой (Зх125 мл). Собранные метиленхлоридные фракции высушивают над сульфатом натрия, фильтруют и о упаривают в вакууме при 30 С.

Получают сырой продукт в виде желтоватых кристаллов, которые затем очищают хромотографией на колонне на 500 г нейтральной окиси алюминия (Йоелм N, супер I), используя эфир в качестве элюента (10 мл фракций).

Фракции 14-36 объединяют и упаривают в вакууме.

Получают метиловый эфир l ol-0-бензил- 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Тп

121-123 (диэтилэфир:нефтяной эфир =

1:2).

Г -3 = +147,9 + 0,1 С (С =

0,849; хлороформ) — 32,2 г (86,2 от теории).

Rf = 0,67 (хлороформ:метанол =

= 9:1).

Пример 5. Аналогично примеру 4 получают иэ 5,5?5 г (6,43 ммоль) сырого (содержит еще незначительное количество дициклогексилмочевины) (Cd)-трет-бутилэфир-(СУ)-N-окси-сукцинимидэфира N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-.

-глютаминовой кислоты и 3,78 г (4,95 ммоль) L-алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютамил-(Сd)-трет.-бутилэфир-(С ф—

-L алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида в виде бесцветного порошка, содержащего 2,64 моль воды.

5oL3 = +2,5 + 0,1ОС (С = 0,649; .вода); д.1 = +5,8 + 0,1 С (С = 0,694; хлороформ);

18

Rf = 0,60 (хлороформ .метанол. вода = 70:30:5), в количестве 4,32 r (64,0% от теории).

Ис;."одный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 3 из 3,44 r (6,15 ммоль) -трет.-бутилэфира

N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глитаминовой кислоты, 1,68 r

l0 (8,14 ммоль) дициклогексилкарбодимида и 0,94 r (8,14 ммоль) N-оксисукцинимида получают сырой (Со )-трет.—

-бутилэфир-(Сg)-N-оксисукцинимидэфир

N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил l5 -D-глютаминовой кислоты в количестве

5,38 r в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину, и используемых без дальнейшей очистки.

Rf = 0,61 (хлороформ:метанол. во20 да = 70:30:5).

Исходный продукт получают следующим образом.

Раствор 5,1 r (7 ммоль) (Cd)-трет.

-бутилэфир-(С )-бензилэфира ld -0-бензил-М-пропионил-деэметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в

100 мл смеси диметоксиэтан:вода =

9:1 гидрируют с 1,5 г 5 .-ного катализатора палладий на угле (Е 101N, 30 Дегуеса) в течение 20 ч при комнатной температуре и нормальном давлении Через 20 ч катализатор отфильтровывают и снова производят гидрирование с 1,5 г свежего катализатора в

35 течение 26 ч как указано. Затем катализатор отфильтровывают и фильтрат упаривают в вакууме до сухого состояния при 30 С.

Полученный таким образом остаток

40 растворяют в смеси, состоящей из

-100 мл метиленхлорида и 5 мл изопропанола, раствор смешивают с 500 мл смеси из диэтилового и петролейного эфира = 3:2 и перемешивают еще l ч

45 при комнатной температуре. Затем отсасывают выпавший в осадок продукт и промывают его диэтиловым эфиром.

Получают Ы -трет-бутилэфир N-пропионилдезметилмурамил-1-алканил-D50 -глютаминовой кислоты в виде бесцвет; ного порошка, содержащего 0,52 моль воды (3 7 г, 94,7,от теории). (К) = +20,2 + 0,1 С (С = 0,902; вода);

Rf = 0,32 (хлороформ:метанол:вода = 70 30 5);

Rf = 0,54 (ацетонитрил:вода =

= 3:1).

12995

Получают исходный продукт следующим образом.

Аналогично примеру 4 получают из

7,3 г (9,5 ммоль) (Сй)-трет.-бутилэфир-(С g)-бензилэфир-1 oL -О-бензил-4,6-0-изопропилиден-пропионил-дезметилмурамил-1-аланил-D-глютаминовой кислоты и 150 мл 60Х-ной уксусной кислоты (Со()-трет.-бутилэфир-(С1 )-бензилэфир 1 Ы -О-бензил-N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов с Т 152-153 С (метанол: о

:вода = 1:5).

Го 3 = +68,9 + 0,1 С (С = 0,991; метанол);

Rf = 0,40 (хлороформ:метанол =

= 9:1);

Rf = 0,70 (ацетонитрил:вода = — 3:1), количество кислоты 5,9 г 20 (85,3% от теории).

Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 4 из 4,65 г (9,62 ммоль, 2,066 ммоль/г, содержит еще хлорид натрия) натриевой соли

1д-О-бензил-4,6-0-иэопропилицен-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты, 2,38 г (11,54 ммоль) дициклогексилкарбодиимида, 1,33 г 30 (11,54 ммоль) m-оксисукцинимида и

3,86, r (9,62 ммоль) гидрохлорида (Сс )-трет.-бутилэфир-(Сф)-бензилзфира L-аланил-D-глютаминовой кислоты получают (C )-трет.-бутилэфир-(СУ)- 35

-бензилэфир 1с -О-бензил-4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмурамил-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащей 0, 31 моль воды.

Ecl) о = +38,4 + 0,1оC (С = 1,086; 40 метиленхлорид);

Rk=0,86 (ацетонитрил : вода = 3 : 1);

Rf = 0,83 (хлороформ:метанол =

9:1), выход кислоты 7,3 г (97,9Х от теории). 45

Пример 6. Аналогично примеру 4 из 3,07 r (4 ммоль) сырого (еще содержит дициклогексилмочевину) (СЫ)-n-бутилэфир-(С 1 )-N-оксисукцинимидэфира И-пропионил-дезметилмурамил- 50

-L àëàíèë-Э-глютаминовой кислоты и

2,37 r (3,1 ммоль) L-аланил-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида получают натриевую соль N-пропионил-дезметилмурамил- 55

-L-аланил-D-глютамил-(C )-n-бутилэфир-(Сф)-?алании-2-(1,2-дипальмитоил-Яп-глицеро-3--оксифосфорилокси)16 20

-этиламид в виде беспветного порошка, содержащего 3,93 моль воды. (д ) = +6 9 + 1о С (C = 0,504; метиленхлорид);

Rf = 0,65 (хлороформ:метанол:вода = 70:30 5);

Rf = 0,63 (хлороформ. метанол = — 7:3), выход порошка 2,93 г (70,9%), Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 4 из 2,2 г (3,9 ммоль) к -n-бутилэфира И-пропионил-дезметилмурамил-L àëàíèë-D-глютаминовой кислоты, 1,2 r (5,8 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и 0,69 г (5,8 ммоль) N-оксисукцинимида получают сырой (Cot)-ü-бутилэфир-(С У)-N— - оксисукцинимидэфир N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты в виде бесцветных кристаллов, содержащих дициклогексилмочевину и используемых без дополнительной очистки (количество кристаллов 3,07 г).

Rf = 0,66 (хлороформ:метанол .вода = 70:30:5).

Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 5 (продолжительность гидрирования 20 мин) из

7,3 г (11,3 ммоль) (Сс )-и-бутилэфир-(С )-бензилэфира N пропионил-деэметилмурамил-L-аланил-Р-глютаминовой кислоты получают eL-n бутилэфир Н-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D — глютаминовой кислоты в виде бесцветного порошка, содержащего

0,88 моль воды, с выходом кислоты

5,8 г(90,9Х от теории) ° (с ) о = +16,4 + 0,1 С (С = 0,959) вода);

Rf = 0,61 (метиленхлорид:метанол:

:вода = ?О:30:5);

ВГ = 0,52 (ацетонитрил:вода = — 3:I).

Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 4 из 9,5 г (l3;97 ммоль) (Сс )-и-бутилэфир-(СУ)-бензилзфир 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметил-мурамил-Т аланил-D-глютаминовои кислоты и 120 мл ь

60%-ной уксусной кислоты получают (Col)-.n-бутилэфир-(Ст)-бензплэфир

N-пропионил-дезметилмурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержаний 0,41 моль воды, (7,5 г, 83%).

9516

35

21 129 (d.3 о = +15,7 + 0,1 С (С = 1,019; метанол);

Rf = 0,23 (метиленхлорид:метанол=

= 9:1);

Rf = 0,45 (метиленхпорид:метанол= — 5:1);

Rf = 0,82 (метиленхлорид:метанол:

:вода = 70:30:5).

Исходный продукт получают следующим образом.

Аналогично примеру 4 из 3,81 г (10,76 ммоль V 2,72 ммоль/г, содержит еще хлорид натрия) натриевой соли 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-дезметилмураминовой кислоты, 2,44 г (11,83 ммоль) дициклокарбодиимида, 1,36 г (11,83 ммоль) N-оксисукцинимида (10,76 ммоль) гидрохлорида (Cpl.)-и-бутилэфира-(Cot)-бензил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты получают (СЫ)-п-бутилэфир-(СЖ)-бензилэфир, 4,6-0-изопропилиден-N-пропионил-десметилмурамил-L àëàíèë-Э-глютаминовой кислоты (4,1 r, 56,2%).

1:o(3, = +10,6+0,1 С (C = 0,9?8; метанол),;

Rf = 0,81 (метиленхлорид:метанол:

:вода = 70:30:5);

Rf = 0957 (метиленхлорид:метанол=

5:1).

Пример 7. К раствору, состоящему из 2,85 r (2,09 ммоль) полученной согласно примеру 5 натриевой соли N-пропионил-десметилмурамил-L àëàíèë-D-глютамил-(C )-трет.-бутилэфир- (C g) -L-аланин — 2-(1, 2-дипалмитоил-Sn — ãëèöåðî-3-оксифосфорилокси) этиламида и 112 мл абс. метиленхлорида, добавляют трифторуксусной кислоты и все перемешивают в течение

3 ч при комнатной температуре, Затем бесцветный прозрачный раствор упаривают в вакууме при 30 Г и полученный таким образом остаток несколько раз вводят в метиленхлорид и снова упаривают..

Получают 3,0 r бесцветного масла, растворенного в 350 мл смеси фосфатбуферного раствора хлорида натрия (по 0,1 М, 1:1, рН = 7), фильтруют в AMICON-диализаторе (модель 402, ультрафильтр РМ 9 30/76 мм) при

3 атм. Затем фильтруют для удаления хлоридов в противотоке в общей сложности 2,1 л бидистиллированной воды.

Раствор, оставшийся в диализаторе (приблизительно 50 мл) лиофилизируют в высоком вакууме. Получают беспветный лиофилизат, который очищают методом хроматографии на колонне на

260 г геля кремневой кислоты (60, 0,063-0,200 мм) в системе хлороформ .

5 :метанол:вода = 70:30:5 (10 мл фракций).

Фракции 90-260 объединяют и упаривают в глубоком вакууме без нагре > ва (охлаждение) до сухого состояния.

Остаток вводят в 250 мл бидистиллированной воды и затем в AMICON-диализаторе (модель 402, ультрафильтр ПМ ф 30/76 мм) упаривают при 3 атм до

;приблизительно 50 мл, затем последовательно фильтруют для удаления хлоридов в противотоке 250 мл фосфатного буферного раствора — хлорид натрия (по 0,1 М 1:l, рН=7) и 175 мл бидистиллированной воды. Раствор, оставшийся в диализаторе, стерильно, фильтруют, затем, пропускают через два фильтра с миллипорами (NAL 0ENES>

0,45 мкм соответственно 0,2 мкм) и

25 лиофилизируют в высоком вакууме, Получают динатриевую соль (СМ)-L-аланин-2 †(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида

N-пропионилдезметилмурамил-L-аланилD-глютаминовой кислоты в виде бесцветного гидроскопического порошка, содержащего 4„8 моль воды. (a 3 = -6,1 + 1 С (С = 0,489; метиленхлорид:этанол = 1:1);

Rf = 0,28 (уксусный эфир. л -бутанол:пиридин. уксусная кислота:вода =

= 41:21:21:6:10);

Rf = 0,62 (ацетонитрил:вода =

3:1), выход соли 1,04 г (36,4Ж).

Пример 8. 4 5 r(ммоль) натриевой соли N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил- (Г d) -трет. -бутилэфир-(С У) -L-алании-2- (1,? -дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида, высушенной в высоком вакууме над пятиокисью фосфора, растворяют в 75 мл сухого дихлорметана. Охлажо дают до 0 С и при помешивании в абсолютных условиях вводят 25 мл безводной трифторуксусной кислоты и затем нагревают до комнатной температуры. Через 2 1/2 ч прозрачный бесцветный раствор упаривают в роторном испарителе при комнатной температуре (приблизительно до 10 мл), многократно смешивают с дихлорметаном в коли. честве по 100 мл и наконец снова упаривают.

)?99516

Сырой продукт дважды очищают пу— тем хроматографии на 400 r геля коемневой кислоты 60 (для каждого раза

400 r) в системе хлороформ:метанол:

:вода = 70:30:5, Продукт, содержащий в 5 ся во фракциях 9-172, растворяют в

100 мл дважды дистиллированной воды и чистят путем фильтрации (AMICON— мешалка 402, ультрафильтр PM

10/76 мм) аналогичнЬ примеру 1. !0

Раствор фильтруют с помощью фильтра с миллипорами (0,2 мкм) и лиофилизируют. Получают:динатриевую соль (С)-)—

-,-аланин-2-(1,2-дипалмитоил-Бп-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида !5

N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютаминовой кислоты, содержащую 4,89 моль воды, в виде бесцветного рыхлого порошка.

2.о

Ed l = 10 + 1 С (С = 0,67-5; мета-20 нол), выход соли 1,1 г (25X)

Rf = 0,08 (хлороформ:метанол:вода = 70:30:5);

Rf = 0,15 (этиловый эфир уксусной кислоты:h-áóòàíîë:ïèðèäèí:óêñóñíàÿ кислота:вода = 42:21:21:6:10);

Rf = 0,30 (хлороформ. метанол:вода:

:уксусная кислота = 70:40:9:1).

Проведены биологические испытания полученных предложенным способом солей мурамилпептидов.

Альвеолярные макрофаги крыс, полученные при промывке легких, инкубируют 24 ч либо с липосомами, включающими активное вещество, либо в физи- 35 ологическом растворе с активным веществом. Вводят опухолевые клетки, мар è5 кированные I. Инкубируют 72 ч ° Погибшие опухолевые клетки отмывают, определяют число живых клеток по их 40 радиоактивности. Активность макрофагов оценивают на основе клеточной токсичности, т.е. по числу животных, погибших при опытах. Удельная клеточная токсичность (Ж) рассчитывалась следующим образом: срм в опухолевых клетках, инкубированных макрофаги активным началом

50 срм в опухолевых клетках, инкубированных макрофаги и PBS

Опыты проведены со следующими соединениями: натриевая соль N-ацетил-му- рамил-L-аланил-D-глютамил †(СР)-Т-аланил-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-r vuepo-3-оксифосфорилокси)-этиламида; натриевая соль N ïðîïèîíèë-нормурамил-I-аланил-D)

-глютамил (С д., -h -бутиловый эфир — (С У) -L-аланил-2- (1 2-дипальмитоил-Яп-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида, (пример 5); натриевая соль N-пропионил-нормурамил-L-аланил-D-глютамил (Cd)-h-метилэфир-(С г)-Ь-аланил — 2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 4); натриевая соль N-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Сс!)-трет.-бутилэфир

-(Г г)-L-алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3.—

-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 3); натриевая соль N-ацетил

-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(СК)метиловый сложный эфир (С г)-L àëàíèí-2-(1,2-дипальмитоил-Нп-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 2); натриевая соль N-пропионил-нормурамил-Ь-аланил-D-глютамил-(СЫ)-сложный трет.-бутиловый эфир-(С )—

-алании †-(1,2-дипальмиттоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида (пример 6). ные результаты сведены в

Т.7

IV—

Получен табл. 1.

Проведено сравнение производных мурамилпептидов обшей формулы Т с известным соединением.

Испытание на пирогенность проведено на кроликах и показало, что при подкожном введении высоких доз, как

30 мг/кг И-ацетил-мурамил-L-аланил-D-глютамил-(Col)-ь-бутилэфир-(С г)-L-алании-2-(1,2-дипальмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламид-соль натрия (соединение II) не наблюдается пирогенного эффекта.

В противоположность этому при тех же дозах натриевой соли N-ацетил-мурамил-L-аланил-D — изоглютаминил-Ь- алании-2-(1,2-дипалмитоил-Sn-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламида (VII) наблюдается сильное повышение температуры.

1299516

26

Результаты испытания на пирогенность при внутривенном введении испытуемых соединений в дозе 1 мг/кг показаны в табл. 2, Результаты показывают, что измене- 5 ние температуры (аТ о С) в случае предложенных соединений примерно в

2-4 раза ниже, чем в случае известного соединения /II. Кроме того, мура) илпептиды формулы Т могут успешно применяться для.профилактики и лечения заболеваний, вызываемых ДНК вЂ” вирусами с кубической симметрией и нуклеокапсидом без оболочки, ДНК вЂ” вирусами с вирионом в оболочке, а также PHK — вирусами с кубической симметрией капсида и PHK — вирусами со спиральной симметрией капсида, Соединения формулы I предпочтительно использовать в случае ДНКвирусов с вирионом в оболочке и кубической симметрией капсида, в случае

PHK-вирусов с кубической симметрией капсида и варионом без оболочки, а также в случае PHK-вирусов со спиральной симметрией капсида, в которых нуклеокапсидная оболочка расположена у наружной поверхности мембраны, и, кроме того, в случае AdenovirЫае, 1, 30

Poxvzrides Coronaviridae, в частности, при человеческих Согопа 1геп.

В первую очередь соединения формулы Т применяют в случае Herpesviridae, picornaviridae, Myxoviren, а также в случае шаз1айепч1геп, в част- З5 ности человеческих заболеваний, причем сильное действие проявляется не только в случае бактериальных возбудителей, но и против вирусных воз- будителей. Эти. соединения проявляют длительное профилактическое или герапевтическое действие, длящееся от многих дней до нескольких недель после однократного приема соединений формулы I, получаемых предложенным способом, а такхе эффективное воздействие на широкий спектр вирусных возбудителей.

Проведены испытания антивирусной активности предложенных соединений.

А = натриевая соль N-ацетилмурамил-?-аланил-D-глютаминовой кислоты-(С г) -L-аланил-2- (1, 2-дипальмитоил-сн-глицеро-3-оксифосфорилокси)=:

-этиламид.

В = натриевая соль N-ацетилмурамил-L-аланил-Э-глютамил-(Сф- -бутиловый сложный эфир-(Сс )-L-аланин-2-(1,2-дипальмитоил-сн-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламид.

С = натриевая соль N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глютамил-(СУ)-метиловый сложный эфир-(Сй)-).-аланин-2(1,2-дипальмитоил-сн-глицеро-3-оксифосфорилокси)-этиламид. Каждую из

20 и 30 самок мьппей — MF-2f HPF ве) сом каждая по 14-16 г заражают через нос, применяя легкую анастезию и используя смесь из равных частей диэтилового эфира, этанола и хлороформа, образующих пластинки единицами вирусовых IBTGMQB Influenza A(Texas)

1/77 (адаптирующихся мьппами) в количестве 1-4 в виде 0,05 мл взвеси вирусов.

В указанный срок для заражения в организм каждой их мьппей вводят единожды (единичная доза) согласно табл, 1 количество активного ингредиента в 0,2 мл 0,005 -ного по весу раствора натрий-карбоксиметилцеллюлозы в дважды дистиллированной воде через нос или через рот.

Остальные из числа укаэанных мышей, т.е. 10 или 20 животных служат в качестве контрольных. им вводят плацебо (0,005 .-ный по массе раствор натрий-карбоксиметилцеллюлозы).

Через нос активный ингредиент вводят, применяя легкую анестезию с использованием смеси из равных частей диэтилового эфира, этанола и хлороформа.

Процентное количество мьппей, оставшихся в живых через 24 дн. после заражения, приведено в табл. 3.

Проведено сравнение с известным антивирусным агентом (действует на вирусы Influenza А) — амантадином.

Действие амантадина начинается только при дозе в несколько мг/кг, значение ЛД для мьппей составляет

700 мг/кг.

Предложенное соединения действуют уже при дозе О,1 мг/кг, в определенных случаях уже при 0,01 мг/кг, в то время как значения для мьппей составляет более 3000 мг/кг, Это зна.—, чит, что диапазон терапевтического действия предложенных соединений по сравнению с амантадином значительно шире. К тому же, предложенные соединения проявляют антивирусное действие уже после их однократного применения не более чем за 7 дн. до зара) 2995I 6

28

СН2ОН 1®

О нс сн(щмн-6R>

/ (в)

О-N — С вЂ” ИНгСН вЂ” СН -СН вЂ” С вЂ” ХН вЂ” CH— - -NH-CH>— - CH;0— - Р-ОСН

1 1

О н Сн3 О С . О CM3 g

О 8 н„— с;с — о- и.

CHzOH выделяют в виде соли. жения или после него, в то время как амантадин необходимо вводить уже до заражения, например за 24ч до заражения, и продолжать ежедневное введение в те— чение неменее 5дн., т.е. предложенные соединения проявляюткак терапевтическое, таки профилактическоедействие, в то время как амантадин проявляет только поофилактическое действие. где R — С -С -алкил;

-R — водород или С,-С -алкил, отличающийся тем, чт . соединение общей формулы Н (БЛн)

И

О ф

H3c CHu)) H с В1

И-) (D) Он о- к-сн-с- нн- н-сн сн -с и i i I 1 О онсн,о с

О OR или его солью, имеющие защитные групгруппы отщепляют и целевой продукт

Кроме того, производные мурамилпептидов обпей формулы I малотоксич— ны. В табл. 4 показана острая токсичность, определенная на мьппах. Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ получения солей мурамилпептидов общей формулы I

Из1 — С вЂ” С вЂ” 0-СН 1(М где R, - имеет указанное значение;

 — С,-С -алкил или защитная группа карбоновой кислоты, вводят во взаимодействие с L-аланил-2-(1,2-дипальмитоил-S -глицеро-Э-. ь

-оксифосфорилокси)этиламидом формулы

ОН (1.)

1 н-м-сн-с-мн-сн,-сн;о-г-о-сн

H3o О о н1с — t: — о — сн о

Hg c — с — Π— сн 1 (sn) 129951 6

Таблица 1

Удельная клеточная токсичность, %

Активное вещество

0,2 мл PB активного ещества, мг/культу ра

0,02 0,2 2 20 0,02 0,2 2 20

51

39 59

21 48 74

10

64 76

64 68

3 81

23 18 20

60

29

Таблица 2 ат, с

Соединение

VI

+2,0

Известное VII

Т а б л и ц а 3

Активн иигреди ент ид ввода

0,1 0 01 0-контроль

100 10 1

80 70 80 n.t

n.t 15

Оральный п.t n.t 58 30

Оральный

Бремя ввода (кол-во дней) перед заражением. после заражения) Активное вещество в 100 мг липосомы на 0,2 мл, мг/культу ра

+1,0

+0,69

+0,65

+0,48

Процентное кол-во мышей, оставшихся в живых после заражения и обработанных количеством аКтивного ингредиента, мг/кг (n.t — not tested — испытания не проводились

32

Продолжение табл. 3

1299516

Активы Вид ввода ннгредн ент

0-контроль

0,01

100 10 1 0 I

Через нос

n t n t 80 60

10

Через нос

n.t n.t 70 90

10

Оральный

В Оральный

70 40 20 50

40 50 30

n.t

Через нос

О п.t

Ораль ный

Оральный

Через нос

Через нос

n t n t 70 50

n t пЛ 50 50

10

10

Таблица 4

Испытуемое соединение

ЛЛ, мг/кг

3150

3460

3380

3110

3420

ВНИИПИ Заказ 906/64 ТиРаж 348 Подписное

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Время ввода (кол-во дней) перед заражением после заракения) Процентное кол-во мышей, оставшихся в живых после заражения и обработанных количеством активного ингредиента, мг/кг (n. t — not teste6 - испытания не проводились

80 30 80 n.t n.t

60 40 70 n.t n.t

n.t n. t 40 55 30