7-замещенные 9 @ -метоксимитозана,обладающие противоопухолевой активностью

 

Изобретение касается производных мнтомизина С, в частности соединений общей формулы I CHj -С СА - С(0)-С« -0(0, сн- -сн,-о - с (о)-в, -c-N-c(ocH,) - сн. CHjСН;NR . м НА, ных ий о)-в, ;NR. где А - OCHj; R R N-CCR) N-; В - (R,,)N-; , CH, формил; R -H; CH.j; каждый в отдельности метил или изопропил или вместе с N -пиперидин или морфолин, которые как обладающие противоопухолевой активностью могут быть использованы в медицине. Для выявления лучшей активности у соединений указанного класса бьши получены новые I, Синтез их ведут из митомицина С или митомицина А или их N-алкилпроизводных с соответствующим амидоацеталем в безводной среде органического растворителя (хлороформ, дихлорметан, а также смесь хлороформа и метанола ) при 50-65 С до получения соединения , где В или А+В представляют собой группу )N-, с последующим хроматографическим вьщелением целевого I, Активность последнего по отношению времени выживания группы, обработанной препаратом, ко времени выживания контрольной группы составляет 141-311% при дозе 25,6-6,4 мг/кг массы(для Р 388 Murin лейкомии). 2 табл. to (Л со о оо 00

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК.80 1301831

А1 (5D 4 С 07 D 487/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

СН, ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2 1 ) 3656356/23-04 (62) 3607001/04 (22) 18. t0.83 (23) 03.06 ° 83 (31) 385149 (32) 04.06.82 (33) US (46) 07.04.87. Бюл. ¹ 13 (71) Бристоль-Мейерз Компани (US) (72) Долатрай Моханлал Виас (СА), Такуси Канеко (JP) и Терренс Вильям

Дойле (СА) (53) 547.759.5 (088.8) (56) Патент США № 3121084, кл. 260-268, 1964 . (54) 7-ЗАМЕЩЕННЫЕ 9а-МЕТОКСИМИТОЗАНА, ОБЛАДАЮЩИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается производных митомизина С, в частности соединений общей формулы I

СА - С(0)-С СН вЂ” -СНг-Π— С(0)-В, 11 ф

СН -C -С(0) -С-N - C(0CH ) - СН

S S

СН гДе А — ИН2; ОСНз, R RqN — С(К ) =N-;

B — R R N-C(R ) =N-; NH; R,-H CH формил; R -Н; СНз Rз 4 в отдельности метил или изопропил или вместе с N †-. . пиперидин или морфолин, которые как обладающие противоопухолевой активностью могут быть использованы в медицине. Для выявления лучшей активности у соединений указанного класса были получены новые I. Синтез их ведут из митомицина

С или митомицина A или их N-алкилпро- изводных с соответствующим амидоацеталем в безводной среде органического растворителя (хлороформ, дихлорметан, а также смесь хлороформа и ме- а о танола) при 50 — 65 С до получения соединения, где В или А+В представляют

СОбОЙ группу RÇR4 N-CR2) N, с пОсле дующим хроматографическим выделением С целевого I. Активность последнего по отношению времени выживания группы, обработанной препаратом,ко времени гг, выживания контрольной группы составляет 141-3113 при дозе 25,6-6,4 мг/кг массы(для P = 388 Murin лейкомии).

2 табл.

О

CH где А — амино-, метокси- или. группа общей формулы 2

R R N — C Nз д

 — амино- или амидиновая группа общей формулы

К

R R N-C=N3 4

20 где К, — водород, формил или метил;

Кд — водород или метил%. 25

К и К вЂ” каждый в отдельности метил з или изопропил или вместе с атомом азота,к которому они присоединены, образуют пиперидин или морфолин, 30 обладающим противоопухолевой активностью, Целью изобретения является поиск в ряду производных митомицина С сое динений, обладающих более высокой противоопухолевой активностью.

Пример 1. 7- ((Диметиламино)

1О метилен ) амино-И (диметиламино) -метилен-9а-метоксимитозан (соединение 1 ).

7-((Диметиламино)метилен)аминою

N -(диметиламино) -метилен-формил9а-метоксимитозан (соединение II).

К суспензии 500 мг (1,50 мИ) митомицина С в 25 мл хлороформа добавля- 45 ют в целом 9,6 мл (2,4 мл порциями через О, 18, 21 и 23ч) N, N-диметил— формамид диметилацеталя и суспензию перемешивают при 50 С в течение 41 ч.

После выпаривания растворителя и избытка реагента при пониженном давлении получают темно-зеленый остаток;

ТХС (хлористый метилен/метанол 20:1) показывает отсутствие митомицина С при наличии двух новых зеленых компонентов (R f = О, 16 и 0,22). Основной компонент (R f = О, 16) выделяют хроматографией мгновенного испарения, используя смесь хлористый метилен

1 13018

Изобретение относится к новым производным митомицина С, а именно к 7замещенным 9а-метоксимитоэана общей формулы

31 2 (метанол 20:1) в качестве элюента, в виде зеленого твердого вещества (340 мг 51,5%), который после растворения в диэтиловом эфире с последующим добавлением гексана дает соединение I в виде темно-зеленого аморфного порошка.

Вычислено

Найдено,7: С 56,20; Н 6,28;

N 17,88.

Вычислено,%: С 56,71; Н 6,08;

N t8,9О.

Второстепенный компонент (R f

0,22) выделяют (180 мг, 25,35%) в в виде аморфного твердого вещества, которое после осаждения из диэтилового эфира и гексана идентифицируют как соединение II °

Найдено,7.: С 55,41; Н 5,96;

N 16,99.

С Н N О, Вычислено,%: С 55,89; Н 5,93;

N 17,78.

В растворах соединений I и ХТ либо в этилацетате, либо в N,N-диметилформамид диметилацетале при стоянии при комнатной температуре более 10 ч происходит преврашение соединения II (R f = 0,22) с соединение I (R

= 0,16), что удостоверяется ТСХ, с получением раствора с повышенным содержанием соединения

Примеры 2-7 выполняют аналогично примеру 1 с модификациями, указанными ниже, с получением различных до— полнительных соединений предлагаемого изобретения.

Пример 2. 7-((Диизопропиламино)метилен ) амино†N " (диизопропиламино)метилен-9а-метоксимитозан (соединение III ).

Суспензию митомицина С (200 мг, 0,6 мМ) в N,N-диизопропилформамид диэтилацетале (3 мл) нагревают при перемешивании в течение 15 ч при 53 С, Реакционную смесь выливают в 50 мл воды и экстрагируют этилацетатом (3 " 30 мл). Объединенный органичесl кий экстракт сушат (Na, SO <) и вы2 паривают с получением темно-зеленого сиропа, ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает наличие основного зеленого компонента с R f = 0,43 и примесей, движущихся быстрее (К f=

= 0,45-0,50). Основной компонент III выделяют в виде темно-зеленого твердого вещества (156 мг, 46,8%) с по1301831

40 мощью двукратной хроматографии мгновенного испарения с использованием . смеси хлористый метилен/метанол 20:1 в качестве элюента.

Найдено,X: С 62,03; Н 7,80;

N 14,60.

Вычислено, 7: С 62, 55; Н 7, 91;

N 15, 10 °

Пример 3. 7-Г(Диметиламино) 10 метилен) амино-N †(диметиламино)— метилен-9а-метокси-Б -метилмитозан ю (соединение IV ), 1О

В этом примере порфиромицин (N метилмитомицин С), 130 мг (0,37 мМ) замещают в качестве исходного соединения в реакции с 0,8 мл (1,5 мМ)

N,N-диметилформамид диметилацеталя, используя 10 мл хлороформа и 2 мл метанола в качестве реакционного растворителя, время реакции 50 мин при 50 С. Соединение IV получают в виде сиропа после выпаривания реакционного растворителя. Это соединение затем очищают хроматографией мгновен- 5 ного испарения, используя 20 г силикагеля и смесь хлористый метилен/метанол (20:1) в качестве элюента.

Найдено,X С 57, 11; Н 6, 11;

N 17,99.

Вычислено,7.: С 57,60; Н 6,55;

N 18,33.

Эта методика дает соединение V

7-амино- N о-диметиламино-метилен-9а- 35 метокси-N1 -метилмитозан, в качестве побочного продукта с выходом 307, ТСХ : R f = 0 40 (хпористый метилен/

/метанол 9:1).

Найдено,X С 54,68; Н 6, 13;

N 16,59 ° вычислено,X С 56,53; Н 6,20;

N 17,38, 45

Пример 4. 9а-Метокси-7- f(1пиперидиниламино) метилену амино1О

N -(1-пиперидинилметилен) митозан (соединение VI ).

N-(диэтоксиметил) пиперидин

50 (3 мл) и митомицин С (200 мг) взаимодействуют при 60 С в течение 2,5 ч в хлороформе (3 мл). Продукт получают с выходом 27,67., ТСХ : R f = 0,20 (хлористый метилен/метанол 20:1).

Найдено,7: С 6 1,01; Н 6,85;

N 15,34.

Са„Hue Ne 0

Вычислено, 7: С 6 1, 79; Н 6,87;

N 16,02.

N 1 -форМил производное предьдущего вещества, N — формил-9а-метокси7-((1-пиперидиниламино)метилен7амино-N -(1-пиперидинилметилен) митозан получают в качестве основного компонента, выход 437, ТСХ : R f

0,25 (хлористый метилен/метанол

20:1).

Найдено,7: С 59,99; Н 6, 17;

N 15,07.

С98Нзб N606

Вычислено,7.; 60,08; Н 6,52;

N 15,21.

Пример 5. 9а — Метокси-7- (1—

1а морфолино) метилен g амино-N (1-морфолино-метилен митозан (соединение VII).

Перемешиваемую суепеHSHto митомицина С (200 мг, 0,6 мМ), в хлороформе (10 мл) и N-диэтокси метилморфолина (4 мл) нагревают при 53 С в течение 42 ч. Реакционную смесь концентрируют до консистенции сиропа под высоким вакуумом. С помощью

"сырой" хроматографии мгновенного испарения (crude fiash Chromatography ) (хлористый метилен/метанол 25:1) отделяют зеленые компоненты от избытка реагентов. Объединенные зеленые реагенты растворяют в 20 мл этилацетата и промывают водой (3 " 20 мл) .

Объединенные промывки реэкстрагируют этилацетатом (3 15 мп). Все этилацетатные фракции объединяют, сушат (Na S04 ) и выпаривают до темно-зеленого сиропа, ТСХ (хлористый метилен/

/метанол 10:1) которого свидетельствует о наличии отдельного компонента с R f = 0,33 и нескольких зеленых примесей (R f 0,35-0,40). С помощью хроматографии мгновенного испарения компонент с R f = 0,33 вьделяют (130 мг, 56,8X) в виде темно-зеленого аморфного твердого вещества, которое характеризуется как соединение VII ).

Найдено,7: С 53,07; Н 6,03;

N 15,37.

Вычислено,X: С 56,78; Н 6,06;

N 15,90. ю

Пример 6. 7-Амино-N -диметиламинометилен-9а-метоксимитозан (соединение VIII ).

200 r митомицина С (0,6 мМ) растворяют в 10 мп хлороформа и 2 мл ме5 13018 танола, добавляют N, N-диметилформамид диметилацеталь (0,64 мп,4,8 мМ) о и раствор перемешивают при 50 С в течение 50 мин ° Тонкослойная хроматография (хлористый метилен/метанол

90:10) показывает следы непрореагировавшего митомицина С (К f = 0,22 ) и два новых компонента (К f = 0,42 и 0,33 соответственно). Раствор концентрируют при пониженном давлении 10 до консистенции сиропа, этот сироп подвергают хроматографии мгновенного испарения (25 г силикагеля), используя хлористый метилен/метанол (20:1) в качестве элюента. 15

Быстрый компонент (R f = 0,42) выделяют в виде зеленого аморфного твердого вещества (60 мг, 22,57) и идентифицируют как соединение I c помощью его ЯМР-спектра (пиридин и ). 20

Основной синий компонент (R f

= 0,33) выделяют в виде аморфного твердого вещества (148 мг, 63,37) и характеризуют как соединение VIII„

Аналитический образец получают осаж- 25. дением из хлористого метилена и н— пентана.

Найдено,X: С 54,70; Н 6, 14;

N 1?,95.

Вычислено,X: С 55,48; Н 5,91;

N i 7, 98.

31 6 амино)этилиден1 -9-метоксимитозан (соединение Х).

600 мг суспензии (1,79 ммоль) митомицина С в 2 мл метанола обрабатывают 3 мл N,N-диметилацетамид диметилацеталя, Затем суспензию нагревают до 75-80 С и перемешивают в течение 2 ч. На этой стадии ТСХ (хлористый метилен/метанол 10:1) показывает, что почти весь митомицин С израсходован в процессе реакции. На хроматографе полученный продукт проявляется в виде зеленой полосы.Растворитель и летучие вещества удаляют концентрированием реакционной смеси досуха при пониженном давлении с получением сиропа, который растворяют в хлористом метилене и наносят на колонку с 40 r силикагеля, после чего колонку элюируют 200 мл 17-ного метанола в хлористом метилене,200 мп

27.-ного метанола в хлористом метилене и 400 мл 57-ного метанола в хлористом метилене. фракции, содержащие зеленую полосу, представляющую собой продукт, объединяют и концентрируют до аморфного твердого вещества, весящего 110 мг. Выход 137.. Это вещество растворяют в 2 мл ацетона и осаждают из раствора добавлением гексана.

Продукт собирают фильтрацией.

Найдено,Х; С 58,89; Н 6,89;

N 17,64.

Вйчислено,X: С 58,46; Н 6,83;

N 17,79, Противоопухолевая активность по отношению к Р-388 Nurine лейкемии.

В табл. 1 приведены результаты лабораторных исследований на CDF мышах-самках, которым внутрибрюшинно имплантировали опухолевый прививочный материал, содержащий 10 асцитных клеток P-388 murine лейкемии, и которым вводили различные дозы тестируемого соединения формулы I или митомицина С.

Соединения вводили путем внутрибрюшинной инъекции. На каждую дозу брали группу из шести мышей, которые получали одну единственную дозу соединения в первый после заражения день. В каждую серию экспериментов включали группу из десяти мышей, которым вводили физиологический раствор, Группы, обработанные митомицином С, были включены в качестве положительного контроля. Для каждой

Пример 7. 7,9а-ДиметоксиN -диметиламинометиленмитозан (соединение IX ).

Вместо митомицина С (пример 1) берут митомицин А (170 мг) и подвер— гают взаимодействию с N N-диметилфор- 0 мамиддиметилацеталем (0,6 мл) в растворе хлороформ/метанол (10: 1) при

50 С в течение 1 ч. Целевой продукт получают с выходом 487, ТСХ : К f

= 0,50 (смесь хлористый метилен/мета- нол 9: 1).

Найдено,X: С 56,51; Н 5,92;

N 13,71.

C„9 9нми,о,.

Вычислено,X: С 56,39; Н 5,94;

N 13,85.

1а

N -формил производное соединение

IX получают в виде соединения IXa

7,9а-диметокси-N -диметиламиномети о лен-N ta-формилмитозана с выходом

16,57., ТСХ : R f = 0,61 (хлористый

55 метилен/метанол 9: 1) .

Пример 8. 7- 1-(Диметиламию но) этилиден j амино-И вЂ” 1.1-(диметил1301831

Т а б л и ц а 1

Среднее изменение веса при дозе "

Соединение Максимальный эффект, Минимально (пример) 7 Т/С доза, мг/кг эффективвеса ная доза максималь- минимально эффек- но эффективной тивной

-0,2

<0,2

+0,3

-1,0

0,1 (0,2

ТТ(1 ) -0,1

+0,1

+0,2

ТХТ(2 ) — 1,2

0,8

-3,8

-1,4

+0,7

ТЧ(3 ) 0,2

144(272 ); 25 6(3э2) +0,2

6,4

V(3 ) 165 (224 ); 12,8 (3, 2 )

300(224 ); 12,8(3,2 ) +0,8

-0,7

0,2

Ч?Т(5 ) -2,1

0,2

Нет

-0,3

-0,4

ЧТТТ(6) 144(272); 6,4(3,2) 3,2

-0,3

144 (272 ); 0,8 (3,2 ) -0,2

-1,0

Ix(7 ) 0,02

+0,3

167(272 ); 6,4(3,2 ) ZXa(7 ) 0,05

194(319 ); 12,8(3,2 ) +0,2

-1,2

Х(8 ) В скобках значения, полученные при введении митомицина С в качестве положительного контроля в том же эксперименте.

" Грамм на мышь; дни 1-6 при максимально и минимально эффективных дозах. тивности при заражении мышей В 16 меланомой коричневой. группы мышей в течение 30 дней отмечали время выживания в днях, а в конце 30-дневного периода регистрировали число выживших особей. Мышей взвешивали перед введением препарата и 5 повторно на 6 день. Изменение веса быпо принято в качестве меры токсичности вещества ° В эксперимент брали мышей весом 20 г каждая и потерю веса до 2 г не считали черезмерной.

Результаты выражали в 7 отношения

Т/С (treated/contro1 ), которое представляет собой отношение времени выживания группы, обработанной npenapaf5

311(244 ); 6,4 (3,2 )

183(272); 6,4(3,2 )

233(244 ) 6э4(3э2 )

141(224 ); 25,6(3,2)

233(272); 12,8(3,2 ) В табл. 2 представлены результаты исследования противоопухолевой актом, ко времени выживания контрольной группы, обработанной физиологическим раствором, которое было принято за 1007. Животные, которым вводили физиологический раствор, обычно погибали не позднее девятого дня.

Таким образом может быть вычислена относительная активность предлагаемых соединений по сравнению с митомицином С, Минимальным эффектом считали 1257 Т/С. Минимально эффективной дозой, приведенной в табл.1 является доза, вызывающая минимальный эффект (1253 Т/С).

1301831 эффективности и для каждого тестируемого соединения определяли максимально эффективную и минимально эффективную дозы. За минимально эффективную

5 дозу принимали такую дозу, которая вызывала 125% Т/С эффект. Для каждой дозы опытным животным внутрибрюшинно вводили тестируемое соединение на

1-й, 5-й и 9-й день. Среднее изменение веса в день, отмеченное при максимально эффективной дозе и при мини— мально эффективной дозе, использовали в качестве меры токсичности. Потеря веса в 2 г для 20 г мыши не считалась черезмерной. Таблица 2

Среднее изменение веса при дозе

Максимальный эффект

7 T/Ñ posa, xr/кг веса

Соединение (пример) Минимально эффективная доза максимально эффективной минимально эффективной

)298(256); 0,8(3,2 ) -0,2(5 )

-0,4(6 ) I(1 ) +0,5 (0,2 (2,0

-0,4

) 295(198 ); 2,0(3,2 ) VII(5 ) В скобках значения контроля с митомицинам С.

Соединения исследовали на противоопухолевую активность по отношению к В 16 Murine меланоме при подкожном введении опухолевого имплантанта и

40 внутривенном введении препарата,Гра" фик введения препарата и значения времени выживания (исследования проводили в течение 40 дней) определяли как указано. На 12-й день измеряли

45 изменение веса. Максимально эффективная доза соединения I была 30 мг/кг °

Эта доза вызывала эффект 156Х T/Ñ и прирост веса 1,5 г. В группы брали по шесть животных, и при этой дозе

50 мыши выживали в течение всех 40 дней.

Минимально эффективная доза была

0,25 мг/кг, при этой дозе на 12-й день изменение веса равнялось 1,0 г.

Минимально эффективную дозу мито55 мицина С не определяли.

В кратком токсикологическом исследовании группам из пяти белых В ВЕ мышей на дозу внутрибрюшинно вводили

Эксперименты проводили на В DF„ мышах, которым внутрибрюшинно инокулировали опухолевый имплантант.

Протяженность эксперимента 60 дней °

На каждую дозу тестируемого соединения брали группу из 10 мышей и для каждой группы определяли время выживания. У контрольных животных,инокулированных так же, как и опытные животные, и инъекцированных растворителем без препарата, время выживания составляло 21 день. Отношение времени выживания опытных животных ко времени выживания контрольных (7. Т/С) использовали в качестве меры

1 однократную дозу соединения. В результате при оптимально эффективной дозе вводимого соединения не наблюдалось значительного уменьшения числа лимфоцитов ° При этой дозе также не отмечалось значительного повышения азота мочевины крови (В un) или сывороточной глютаматфосфотрансферазы (SIPT ), что указывает на отсутствие неблагоприятного воздействия на функцию почек или печени, а также на то, что препарат не подавляет активность лимфоцитов.

Ввиду высокой противоопухолевой активности, выявленной в экспериментах на животных, а также пониженной токсичности в сравнении с митомицином С данное изобретение включает испол зование соединений общей формулы I для подавления опухолевого роста у млекопитающих. В этих целях они применяются системно (по всему организму) у млекопитающих, имеющих

130183 1

R

К R N-C=N3 4

7-Замещенные 9а-метоксимитозана общей формулы

Составитель И.Бочарова

Редактор С.Пекарь Техред В.Кадар

Корректор И.Эрдейи

Заказ 1191/26 Тираж 372 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, ул.Проектная,4 опухоли, в основном в нетоксичных противоопухолевых эффективных дозах. формула изобретения где А — амино-, метокси- или группа общей формулы

 — амино- или амидиновая группа

5 общей формулы

К

R R N-C=N3 4

R„водород, формил или метил;

Rä — водород или метил;

R и К вЂ” каждый в отдельности метил з или изопропил или вместе с атомом азота, к которому они присоединены, образуют

15 пиперидин или морфолин, обладающее противоопухолевой актив- ностью,