Ферментативный способ определения концентрации антибиотика с бета-лактамным кольцом

 

Изобретение относится к медицине и может быть применено при определении присутствия антибиотиков в биологических жидкостях и его концентрации в процессах ферментации. Цель изобретения - повышение чувствительности способа путем использования фермента, иммобилизованного ковале нтно на пoли-(N,N-димeтилaкpиднoй) смоле сетчатой структуры. Для этого исследуемую пробу инкубируют с D-аланил-В-аланин-карбоксипептидазой, продуцируемой Actinomadura R 39. Затем инкубируют полученный комплекс антибиотика и фермента с раствором субстрата N-альфа, N-эпcилoн-диaцeтил-L- -лизил-В-аланил-В-аланина или N-альфа-ацетил-Ь-лизил-В-аланил-В-аланина. Далее определяют концентрацию образовавшегося В-аланина, а по ней - остаточную ферментативную активность. Определяют количество антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем. 5 табл. G со со со сл со сн

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

0Ю (111

А3

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTV

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3546754/28-14 (22) 28.01.83 (31) 8202790 (32) 01.02.82 (33) GB (46) 23.05.87. Бюл. Ф 19 (71) ЮЦБУ С.А. (BE) (72) Жак Дежелаен, Альбер Лоффе и Жан-Пьер Дюрье (ВЕ) (53) 615.799.9(088.8) (56) I.-M. Frere et.al. Molecular

#eight, Amino Acid Composition and

Physicochemical Properties of the

Exocellular DD-carboxypeptidaseTranspeptidase of Streptomyces R 39.—

"Biochem". 1974, 143, р.233-240.

I.-М.Frere, D.Klein, I.-M.Ghuysen.

"Antimicrobial Agents and Chemoterapy", 1980, 18, М- 4, р.506-510. (54) ФЕРМЕНТАТИВНЫЙ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ

КОНЦЕНТРАЦИИ АНТИБИОТИКА С БЕТА-ЛАКТАИНЫМ КОЛЬЦОМ (51)4 С 12 Я 1/04 // С 12 N 9/52 // (C12N9/52, C12R

ЗСЕЮОЮЗЕИ (57) Изобретение относится к медицине и может быть применено при определении присутствия антибиотиков в биологических жидкостях и его концентрации в процессах ферментации. Цель изобретения — повышение чувствительности способа путем использования фермента, иммобилизованного ковалентно на поли-(N,N-диметилакридной) смоле сетчатой структуры. Для этого исследуемую пробу инкубируют с D-аланил-D.— àëàíèí-карбоксипептидаэой, продуцируемой Actinomadura K 39. Затем инкубируют полученный комплекс антибиотика и фермента с раствором субстрата N-альфа, N-эпсилон-диацетил-L-лизил-D-аланил-D-аланина или N-альфа-ацетил-L-лизил-D-аланил-D-аланина.

Далее определяют концентрацию образовавшегося D-аланина, а по ней — остаточную ферментатнвную активность.

Определяют количество антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем. 5 табл.

1313353 2

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано для определения присутствия антибиотиков в биологических жидкостях и его концентрации в процессах ферментации.

Целью изобретения является повышение чувствительности способа за ..чет использования иммобилизованного фермента.

Пример i. .Определение концентрации пенициллина С в молоке, Используемую в качестве подложки смолу поли-(Ы,N-диметилакриламид) получают путем сополимеризации, осуществляемой в эмупьсии, смеси 12 r

N,N-диметилакриламида, 1 r N,N-этиленбисакриламида и 1,4 г сложного метилового эфира N-акрилоилсаркозина.

Получают 12-13 r смолы, имеющей вид жемчуга, гранулометрический состав которого равен 0,1-2 мм.

10 r смолы вводят в 320 мл этилендиамина, полученную смесь перемешивают в Течение ночи при температуре окружающей среды. Затем смолу отфильтровывают и последовательно промывают ее в N,N-диметилформамиде и воде до установления нейтральной величины рН.

Далее смолу промывают в метаноле и оставляют для устранения набухания в присутствии простого диэтилового эфира.

Получают 10 г смолы, содержащей

0,3 моль этилендиамина на 1 r.

6,7 r глутаровой кислоты и 12,7 r

N-оксисукцинимида растворяют в 50 мл о

N,N-диметилацетамида при О С. Затем в полученный раствор вводят по каплям раствор дициклогексилкарбодиимица (23, 7 г) в дихлорметаке (50 мл);

Смесь оставляют до уравнивания температуры раствора с температурой окружающей среды, а затем после выдержки в течение ночи осуществляют фильтрование реакционной смеси H выпаривание фильтрата. Остаток кристаллизуют в простом диэтиловом эфире„ Получают сложный диэфир N-оксисукцинимида глутаровой кислоты при квазиколичественном выходе.

500 мг смолы поли-(N,N-диметилакриламид), содержащей функциональ— ные группы, полученные от этилекдиамина (этап о ), суспекдируют в 50 мп

N,N-диметилацетамида. Затем в смесь вводят 2 г сложного диэфира N-o -cисукцинимида глутаровой кислоты (этап F ). Полученную смесь перемеши5

f5

50 вают в течение 24 ч при температуре окружающей среды. Смолу отфильтровывают и пятикратно промывают в 100 мп

N,N-диметилацетамида, а затем в 100 мп метанола, смолу оставляют для устранения набухания в присутствии просто" го диэтилового эфира.

600 мг очищеннсго фермента R 39 с удельной активностью 19,8 ед./мг протеина (1 ед. фермента R 39 катализирует гидролиз 1 ммоль М-альфа, Ы-эпсилон-диацетил-I. — ëèзил-0-аланило

-D-аланина в 1 и при 37 С при инкубации фермента с раствором 8 мМ субстрата в буферном растворе трис-НС1

0,03 M (рН 7,5), содержащем 3 мМ

MgC1 ), растворяют в 1 мл буферного раствора трис-HCl О., 1 М (рН i,7), содержащем NaC1. О,? М и МяС1 0,05 И, и подвергают диализу в течение 6 ч против 200 мл буферного раствора Hepea О, 1 М (рН 7,7), содержащего NaC1

О,! М и MgC1 0,05 N. Диализ понто ряют 4 раза.

100 мг поли(М,N-дим тилакриламидной) смолы, полученной по этапу 5, оставляют кабухать в 50 мл N,N-диметилацетам:да . Пр:...ерно через 3 ч частицы достигают со ..ки максимального набухакия, и:.ñë 7 отфильтровывают и пятикратно про: ь. ахают в 100 мл буферкого раствора ::.вез 0,1 М (рН 7,7), а затем повторяют промывку в 100 мл буферного раствора Нерея 0,1 М (рН 7,. 7) „содержащем NaC1 0,1 М и

NgC1 0,05 И„

Получечкую влажную смолу помещают в колбу объемом 10 мл,. прибавляют

70 мкг фермента R 39, растворенного в 1,75 мл раствора Нерея О, N, содержащегo О М Na(1 H 0 05 И И8С1

Затем колбу вращают со скорос.ью

100 об./мин в течение 16 ч при температуре акр "кающей среды.

Смолу отфильтровывают, пятикратно промывают в О мл буферного pacòвора

crepes О, 1 М (рН 7., 7), содержащем

0,1 И NaC1 и 0,05 И NgC1 . Затем смолу выдер,швают под вакуумом в тече= ние 30 мнн.

Получают 503 мг смолы, Ферментативная активность фермента R 39 иммобилизоваккого >а смоле,, соответствует

1 мкг. Выход или производительность иммобилизации сос тавляет 2!Е.

Готовят раствор субстрата„ содержащий 6 мг N-альфа, N-эпсилон -гНаретил-L-лизин-Г-ал=- нил-à — а ...кина или

1313353 4

N-альфа-ацетил-L-лизил-D-ала нил-D— аланина в 1 мп воды.

Готовят суспенэию, содержащую 5 мг

D-аминокислоты-оксидазы (специфическая активность 15 ед./мг) в 1 мл вод- 5 ного трехмольного раствора сульфата аммония.

Готовят раствор флавийа-аденинадинуклеотида (ФАД), содержащий 500 мкг

ФАД в 6 мл буферного раствора трис- 10

НС1 0,1 М (рН 8,0).

Приготавливают раствор, содержащий 50 мкг пероксидазы в 1 мп воды, и раствор, содержащий 2,6 мг дихлоргидрата о-дианизидина в 500 мкл воды. 15

Определение проводят следующим образом.

Готовят серию образцов по 1 мл молока, в которых содержится известная концентрация пенициллина С, а также 20 два образца (белый и сравнительный) без пенициллина С. К каждому образцу прибавляют 5,5 мг иммобилиэованного фермента R 39 и инкубируют смеси в течение 20 мин при 37 С. После инку- 25 бации молоко отделяют от фиксированного фермента, промывают последний трехкратно в 1 мл буфера Нерея 0,1 М (рН 7,7), содержащего О, 1 M NaC1 и

0,05 М MgC1 . Затем к ферменту добавляют 20 мкл буфера Нерея 0,1 M (рН 7,7), содержащего О, 1 М NaC1 и

0,05 М MgC1 и 10 мкл раствора субстрата (для сравнительного образца и образцов, содержащих пенициллин G) 35 или 20 мкл буферного раствора Нерея и 10 мкл воды (для белого образца) .

Инкубируют смеси в течение 30 мин о при 37 С. В процессе инкубации прибавляют в полученную смесь 2 мкл сус-40 пензии; D-аминокислоты-оксидазы, 60 мкл раствора ФАД. 1.0 мкл раствора пероксидазы и 5 мкл раствора о-дианизидина. Затем смеси дополнительно инкубируют в течение 10 мин при 37 С.45

На спектрофотометре измеряют оптическую плотность полученных окрашен\ ных растворов. Для этого вводят. 1 мп раствора метанол — вода (1: 1) в кювету и измеряют оптическую плотность при 460 нм.

Вьг итают значение оптической плотности, найденное для белого образца, из значений, полученных для сравнительного образца и всех других образцов. Затем вычисляют процентное выражение остаточной ферментативной активности для каждого образца, исходя из значений оптической плотности, полученных ранее.

Результаты определения концентрации пенициллина G в молоке двух серий образцов приведены в табл.1.

Полученные результаты воспроизводят в виде графика, по оси абсцисс которого откладывают концентрации пенициллина в ед.акт./мп, а по оси ординат — процентное выражение остаточной ферментативной активности. .Этот график служит эталоном в последующих определениях концентрации антибиотика в молоке.

Данным способом определяют концентрацию антибиотика порядка 0,0005 ед. акт./мл молока (известным способом—

0,01 — 0,001 ед.акт./мл исследуемой жидкости).

Пример 2. Определяют концентрацию пенициллина G в сыворотке или моче. Опыт проводят аналогично примеру 1, используя 1 мл сыворотки или мочи.

Результаты определения концентрации пенициллина С в сыворотке представлены в табл ° 2.

Результаты определения концентрации пенициллина G в моче представлены в табл.3.

При использовании сыворотки и мочи способ позволяет определять концентрацию пенициллина G 0,003 ед,акт./мл.

Известный способ не позволяет определять пенициллин в моче.

Пример 3. Опыт проводят аналогично примерам 1 и 2, но в сыворотке определяют концентрацию цефалоспорина С.

Результаты определения концентрации цефалоспорина С в сыворотке приведены в табл.4.

Пример 4. Определение концентрации цефалоспорина С в сыворотке при высокой температуре.

Опыт осуществляют в условиях, аналогичных примеру 3, но инкубацию осуо ществляют при температуре.47 С, время инкубации сокращают вдвое. К каждому образцу сыворотки объемом 1 мл прибавляют предварительно 100 мкл буферного раствора Нерея 0,5 M (pH 7,7), содержащего NaC1 0,5 М и MgC1 0,25 М.

Результаты определения приведены в табл.5.

Иэ данных опыта следует, что способ можно осуществлять при повышенной

13353 6 нина, с последующим определением количества образовавшегося D-аланина, по концентрации которого определяют остаточную ферментативную активность, и определением количества антибиотика по разности концентраций фермента по сравнению с контролем, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повьппения чувствитечьности способа, 10 инкубирование пробы осуществляют с ферментом, иммобилизованным ковалентно на поли-(N,N-диметилакриламидной) смоле сетчатой структуры, перед инкубированием с.раствором субстрата

15 комплекс антибиотика с ферментом отделяют и промывают буферным раствором с рН 7.,7.

Таблица

Остаточная ферментативная активность, Е

Оптическая плотность

Концентрация антибиотика, ед.акт./мл

Цвет

Образец при 460 нм найденная

Первая серия

О Светло-желтый

О, 0082

0,0041

О! 0020

0,0010

0,0005

0,000

0,0О5

О, 000

О, 115

О, !35

0,035

0,040

О, 035

0,150

О, 170

82 Коричневый

Сравнительный

О, 165

100

0,200

О, 035

Светло-желтый

Белый

Вторая серия

3 Св тло-желтый

О, 040

0,055

О, 100

О, 145

0,005

0,020

0,065

0,110

0, 0020

О, 0015

О, 0010

О, 0005

1 2 Же.I тый

Сравнительный

100 Коричневый

О, 160

0,195

О, 035

Светло-желт:-.!й

Белый

5 13 температуре, ускоряя время проведения опр еделе ния .

Формула изобретения

Ферментативный способ определения концентрации антибиотика с бета-лактамным кольцом в биологической жидкости, путем инкубирования исследуемой пробы с D-аланил-D-алании-карбоксипептидаэой, продуцируемой Ассжоmadura R 39, с последующим инкубированием полученного комплекса антибиотика с ферментом с раствором субстрата N-альфа, N-эпсилон-диацетил-L"лиэил-D- àëàíèë-D-аланина или Nальфа-ацетил-L-лиэил-О-аланил-D-ала69 Желто-коричневый

41 .Же. ITQ корич невый

1313353

Та блица 2

Концентра- Оптическая плотность ция 9 ед.акт./мп при 460 нм найденная

Цвет

Образец

Светло-желтый

Сравнительный

100

О, 1 15

О

Белый

ТаблицаЗ

Оптическая плотность

Цвет

Образец при 460 нм найденная

Светло-желтый

Сравнительный

О, 120 1 00

Коричневый

Светло-желтый

Концентрация, нг/мл

Оптическая плотность

Цвет

Образец при 460 нм найденная

Светло-желтый

Желто-коричневый

Сравнительный

100

О, 125

Коричневый

Светло-желтый

О, 010

О, 003

Концентрация, ед.акт./мп

О, 010

О, 003

О, 030

0,035

О, 145

О, 030

0,035

0,040

0,150

0,030

О, 030

О, 040

О, 085

О, 155

О, 030

0,000

0,005

О, 005

09010

0,000

0,010

О, 055

Остаточная ферментативная активность, %

Остаточная ферментативная активность, %

Остаточная ферментативная активность, %

Коричневый

Светло-желтый

1313353

1 а б и и ц а 5

Концентра- Оптическая плотность ция, нг/мл при 460 нм найденная

Цвет

Образец

Светло-желтый

О

Желто-коричневый

Сравнительный

О, 145

Коричневый

100

Светло-желтый

Белый

Составитель Г.Смирнова

Редактор Н.Лазаренко Техред Х.Ходанич Корректор Е.Рашко

Заказ 1984/59 Тираж 500 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г.Ужгород, ул.Проектная, 4

0 040

О, 035

О, 095

0, 180

О, 035

0,005

О, 000

О, 060

Остаточная ферментативная активность, 7.