Способ количественного определения адениновых нуклеотидов

 

Изобретение относится к области биохимического анализа. Целью изобретения является снижение предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращение расхода ферментов. Способ осуществляется с помощью соиммобилизованной системы люциферазы,аденилаткиназы и пируваткиназы. В качестве источника люциферазы и аденилаткиназы используют неочищенные лампочки светляков Luciola mingrelica. Массовое соотношение лампочек светляков : : пируваткиназа : бромциансефароза составляет 50:(3-12):(50-100). Способ позволяет снизить расход дорогостоящих высокоочии енных ферментов и повысить чувствительность определения. Способ может найти применение в медицине , пищевой промьшленности и в научных исследованиях. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„,, 1317027

А1 (50 4 С 12 Q 1/66

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3974546/31-13 (22) 30.08..85 (46) 15.06.87. Бюл. 1 - 22 (71) ИГУ им. M.Â,Ëîìîíîñîâà (72) Г.Д.Кутузова, Н.Н,Угарова, Е.Н.Дружинина и И.В.Березин (53) 577,15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

Р 987976, кл. С 12 N 9/02, 1981, Авторское свидетельство СССР

Р 1045668, кл. С 12 Q 1/66, 1982. (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДЕНИНОВЫХ НУКЛЕОТИДОВ (57) Изобретение относится к области биохимического анализа. Целью изобретения является снижение предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращение расхода ферментов. Способ осуществляется с помощью соиммобилизов анной системы люциферазы, аденилаткиназы и пируваткиназы. В качестве источника люциферазы и аденилаткиназы используют неочищенные лампочки светляков Luciola mingrelica. Массовое соотношение лампочек светляков пируваткиназа : бромциансефароза составляет 50:(3-12):(50-100), Способ позволяет снизить расход дорогостоящих высокоочищенных ферментов и повысить чувствительность определения.

Способ может найти применение s медицине пищевой промьппленности и в наУ ф учных исследованиях, 027

f0

25 (2) АТФ+пируват

1 1317

Изобретение относится к биохимическому анализу, а именно к способу определения адениновых нуклеотидов: ( аденозин-5 -монофосфата (АМФ), аденоI зин-5 -дифосфата (АДФ) и аденозин-5 -трифосфата (АТФ).

Цель изобретения — снижение предела обнаружения, а также сокращение

° расхода ферментов при определении адениновых нуклеотидов.

Способ заключается в следующем, В качестве источника люциферазы и аденилаткиназы используют содержащий оба фермента экстракт лампочек светляков Luciola mingrelica, который получают экстракцией 0 1 M фосфатным буфером, содержащим 0,2 M NaC1 и

2 MM ЭДТА, рН 8,0 в течение 12 ч при 4 С при весовом соотношении лампочки светляков — буфер от 1:40 до

1:10. Экстракт лампочек светляков и грубоочищенный препарат пируваткиназы из мыльц кролика соиммобилизуют на бромцианактивированной сефарозе. При иммобилизации используют 50 мг/мл лампочек светляков, концентрацию пируваткнназы варьируют от 3 до 12 мг/

/мл и носителя от 50 до 100 мг/мл, При концентрациях пируваткиназы ниже 3 мг/мл получаются препараты с низкой пируваткиназной активностью, что уменьшает скорость превращения

АМФ и АДФ в АТФ и приводит к увеличению расхода реагентов и времени анализа, При концентрациях пируваткиназы выше 12 мг/мл препараты имеют низкую люциферазную активность, что . уменьшает чувствительность определения нуклеотидов. При использовании концентрации бромцианактивированной сефарозы при иммобилизации ниже

50 мг/мл происходит потеря дорогостоящих ферментов, вследствие их неполного связывания с носителем, а при использовании выше 100 Mr/мл c.ефарозы получаются препараты с низкими люциферазной, аденилаткиназной и пируваткиназной активностями, которые не дают высокой чувствительности при анализе.

Повышение чувствительности определения АТФ и АДФ с помощью соиммобилизованной полиферментной системы по сравнению с растворимой, по-видимому, обусловлено увеличением локальной концентрации ферментов и продуктов вблизи поверхности носителя, Это увеличивает стационарные скорости ферментативных реакций в иммобилизованной полиферментной системе и облегчает диффузионный перенос субстратов и продуктов одной ферментативной реакции к активному центру другой. В соиммобилизованной полиферментной системе уменьшается влияние побочных факторов за счет пространственного разделения ферментов на носителе, уменьшается ингибирующее влияние пируваткиназы на люциферазную реакцию, что наблюдается при работе с растворимыми ферментами. Кроме того, вследствие, локального концентрирования вблизи носителя образовавшаяся

АТФ подвергается меньшему гидролизу, чем было бы в растворе. Все эти факторы обеспечивают гораздо большую эффективность соиммобилизованной полиферментной системы по сравнению с растворимой„

Анализ адениновых нуклеотидов с помощью препарата соиммобилизованных люцифераэы, аденилаткиназы и пируваткиназы проводится следующим образом по схеме: пируваткиназа

АДФтфо сфо ее оп парти ат люцифераза

Афф -лоцифериито А((фт

+оксилюциферин+неорганич.фосфат+

+С02+ h3 (3)

АТФ определяют с этим препаратом известным методом по реакции (1). Соиммобилизованные с люциферазной аденилаткиназа и пируваткиназа не влияют на чувствительность определения.

Интенсивность излучения прямо пропорциональна концентрации АТФ.

Для определения АДФ его сначала превращают в АТФ по реакции (2) при инкубировании с препаратом соиммобилизованных ферментов и фосфоенолпируватом в течение 1 мин. Полученную

АТФ определяют аналогично, Для этого. после добавления к смеси люциферинсодержащего буфера регистрируют излучение, интенсивность которого пропорциональна концентрации АДФ в системе.

Неизвестную концентрацию АДФ определяют из калибровочной прямой.

Для определения АМФ его превращают в АТФ по реакциям (1 и 2) инкуби1317027 рованием сначала в течение 30 мин с полиферментным препаратом и цитидин-5 -трифосфатом (ЦТФ), а.затем 1 мин с фосфоенолпируватом. Получающийся

АТФ определяют как было указано. Пос- 5 ле добавления люциферинсодержащего буфера регистрируют сигнал, который пропорционален содержанию АИФ в системе. Неизвестную концентрацию АМФ определяют из калибровочной прямой. >О

С помощью предлагаемого препарата соиммобилизованных ферментов можно определять как общее содержание адениновых нуклеотидов в образце, так и содержание каждого из них в отдельности, причем для определения АМФ и

АДФ необходимо предварительное отделение АТФ от других адениновых нуклеотидов, поскольку содержание АТФ .в биологических образцах, как правило, 20 в несколько раз вышее, чем АМФ и АДФ.

Отделение АТФ производят с помощью ионообменной хроматографии на ДЭАЭцеллюлозе.

Способ поясняется следующими примерами.

Пример 1. Получение препарата соиммобилиэованных ферментов, 50 мг лампочек светляков экстра— гируют 1 мл 0,1 M Na-фосфатного буфера; 0,2 M NaCl; 2 мМ ЭДТА; рН 8,0 о при 4 С в течение 12 ч. 1 мл экстракта инкубируют с 50 мг набухшей бромциансефарозы и 7 мг пируваткинао зы в течение 24 ч при 4 С. Осадок промывают по 5 раз попеременно 5 мл

0,02 М Na-ацетатного буфера (1 М, NaC1, рН 4,0) и 5 мл тес -ацетатного буфера (1 M NaC1, рН 8,5), а затем 40

5 раэ по 10 мл дистиллированной водой и 5 раз по 5 мл 0,1 M rp>c-ацетатного буФера, рН 7,6, 2 мМ ЭДТА. Концентрация полученной суспензии иммобилизованных Ферментов 10 мг/мл, активность 4> люциферазы в препарате — 42000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы—

12 Е/мг носителя.

Определение АТФ.

1 мп раствора, находящийся в пласт-50 массовой кювете, содержащий 1 мг/мл суспензии ссиммобилизованных ферментов, 1 MM люциферин, 2 MM ЭДТА, 10 мМ

MgS0 в 0,1 М трис -ацетатном буфере рН 7,8 помещают в люминометр и изме- 55 ряют фоновое свечение, которое для данного препарата не превышает 0,1 мв..

Затем к этому раствору добавляют

50 мкл раствора АТФ известной концентрации, не прерывая регистрации свечения. Разность между интенсивностью сигнала в присутствии АТФ и фоновым сигналом пропорциональна концентрации АТФ, Опыты повторяют для растворов АТФ с концентрациями АТФ в том же диапазоне, в котором предпо-. лагается вести измерения, На основе полученных данных строят график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АТФ. Для полученного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость наблюдается в диапазоне концентраций АТФ 10 пИ-0,10 мМ. Концентрацию АТФ в неизвестном образце определяют по полученному калибровочному графику, Предел обнаружения

АТФ с помощью этого реагента составляет 10 пМ.

Определение АДФ.

К 0,7 мл 0,1 м три< -ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в пластиковой кювете для люминометра и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мИ MgSO<, 20 MM ацетата калия и 5 мИ фосфоенолпирувата, добавляют 50 мкл раствора

АДФ известной, концентрации и 0,1 мл суспенэии соиммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. После инкубирования смеси в течение

1 мин при комнатной температуре кювету помещают в люминометр, добавляют 0;3 мл люциферина до получения в кювете концентрации 1 мИ и регистрируют сигнал, который прямо пропорционален концентрации АДФ в системе.

Опыты повторяют для растворов АДФ с концентрациями в том же диапазоне, в котором предполагается вести измерения. На основе полученных данных строят калибровочный график зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации АДФ, с помощью которого определяют концентрацию АДФ в неизвестном образце, Для полученного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость наблюдается в диапазоне концентрации АДФ 10 пМ вЂ” 0,10 мИ. Предел обнаружения АДФ для этого ферментного препарата составляет 10 мИ.

Определение АМФ.

К 0,6 мл 0,1 M трис -ацетатного буфера рН 7,8, находящегося в кювете, и содержащего 2 мМ ЭДТА, 10 мМ MgS0

20 мМ ацетата калия и 1 мМ ЦТФ, добавляют 50 мкл раствора АМФ известной 13) 7027

»О концентрации и 0,1 мл суспензии соиммобилизованных ферментов (10 мг/мл) в том же буфере. Смесь инкубируют в течение 30 мин, перемешивая, после чего добавляют 50 мкл 0,1 М фосфоенол-5 пирувата, Кювету помещают в люминофор и через 1 мин вводят 0,2 мл люциферина (концентрация его в клозете 1 MM) и регистрируют излучение. Поскольку интенсивность биолюминесценции про- 10 порциональна концентрации АМФ в системе, то используя известные концентрации АМФ в том диапазоне, в котором предполагается вести измерения, строят калибровочный график. Неизвестную концентрацию АМФ находят по сигналу биолюминесценции, используя калибровочную прямую, Для данного препарата соиммобилизованных ферментов прямо пропорциональная зависимость по АМФ 20 наблюдается в диапазоне концентраций

1 нМ вЂ” 0,10 мМ. Предел обнаружения

АИФ для данного ферментного препарата составляет 1 нМ.

Пример 2, Получение препара- 2» та соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 3 мг пируваткиназы при тех же концентрациях всех остальных веществ. Полученный препарат обладает люциферазной активностью 55000 мв/мг носителя и пируваткиназной активностью 8 E/мг носителя.

Определение АТФ с полученным фер- 3» ментным препаратом проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых концентраций АТФ и предел обнаружения АТФ такие же, как в примере l.

Определение АДФ проводят также, как в примере 1. Чувствительность анализа не зависит от концентрации используемой при определении суспензии. Диапазон определяемых с данным препаратом соиммобилизованных фермен- 4» тов концентраций АТФ составляет

50 nM — O,l мМ. Предел обнаружения—

50 пИ.

Определение АМФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых концентраций АМФ 1,0 нМ вЂ” О,1мМ.

Предел обнаружения АМФ вЂ” 1 О нИ.

Пример 3. Получение препарата соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 12 мг пируваткиназы при всех прочих равных концентрациях и

6 условиях, Полученный препарат имеет активность люциферазы 35000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы25 Е/мг носителя.

Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводят также, как в примере 1. Сигнал биолюминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне 50 пМ—

0,1 мМ. Предел обнаружения АТФ—

50 пМ, Определение АДФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АДФ вЂ” 50 пМ -0,1 мМ, Предел обнаружения АДФ 50 пМ.

Определение АИФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным ферментным препаратом концентраций АМФ составляет 5 нМ—

0,1 мМ, Предел обнаружения АМФ 5 нМ.

Пример 4. Получение препарата соиммобилизованных ферментов.

Препарат получают также, как в примере 1, но при иммобилизации используют 100 мг бромцианактивированной сефарозы. В полученном препарате активность люциферазы составляет

25000 мв/мг носителя и активность пируваткиназы 9 Е/мг носителя.

Определение АТФ с полученным полиферментным препаратом проводят также, как в примере 1. Сигнал биоЭ люминесценции пропорционален концентрации АТФ в диапазоне, О,1нМ вЂ” 0,1 мМ, Предел обнаружения АТФ вЂ” О,1 нМ.

Определение АДФ проводят также, как в примере 1, Диапазон определяемых с данным препаратом концентраций

АДФ составляет 0,1 нМ вЂ” 0,1 мМ. Предел обнаружения АДФ вЂ” 0,1 нМ.

Определение АМФ проводят также, как в примере 1. Диапазон определяемых с данным полиферментным препаратом концентраций АИФ составляет 5 нМ0,1 мИ, Предел обнаружения АИФ—

5 нИ, С помощью полученных препаратов соиммобилизованных на бромцианактивированной сефарозе люциферазы, пируваткиназы и аденилаткиназы возможно определять как сумму всех адениновых нуклеотидов в образце, так и содержание каждого из них в отдельности (последнее реально при условии отделения АТФ от АИФ и АДФ).

Наилучшими полиферментными препаратами, позволяющими определять все

Формула изобретения

Составитель Л.Борисова

Техред М.Ходанич Корректор Jl,Ïàòàé

Редактор И.Сегляник

Заказ 2394/23

Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 13170 адениновые нуклеотиды с высокой чувствительностью вплоть до концентраций 10 пМ являются препараты, в которых при иммобилизации на 50 мг/мл лампочек светляков использовались пируваткиназа в диапазоне концентрапий.от 3 до 12 мг/мл и носитель бромцианактивированная сефароза в диапазоне концентраций 50-100 мг/мл.

Препараты, полученные с меньшей и с 1О большей концентрацией пируваткиназы и носителя, чем указанные в диапазоне, обладают меньшей чувствительностью, и их можно использовать для определения адениновых нуклеотидов с 15 концентрациями не ниже 1 нМ.

Изобретение обеспечивает повышение чувствительности способа определения АТФ и АДФ в сотни раз по сравнению с известными методами. С исполь- 20 зованием полученного препарата соиммобилизованньтх ферментов способ оп ределения становится проще. За счет сокращения числа операций, увеличивается экономичность процесса; умень- 25 шается его стоимость за счет использования неочищенных ферментов, воэможности многократного использования одного препарата и увеличения стабильности ферментов после их иммоби- 30 лизации. Полученный препарат может быть использован в научных целях для изучения метаболизма адениновых нук27 8 леотидов различных биологических объектов, а также для определения активности АТФ, АДФ и АМФ вЂ” зависимых ферментов. Он может также использоваться в целях медицинской диагностики, в пищевой промышленности и микробиологической промьппленности для контроля за уровнем адениновых нуклеотидов.

Способ количественного определения адениновых нуклеотидов, предусматривающий проведение ферментных реакций с использованием люциферазы, аденилаткиназы лампочек светляков

Luciola mingrelica и пируваткиназы с последующей регистрацией продуктов биолюминесцентным методом, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью снижения предела обнаружения адениновых нуклеотидов и сокращения расхода ферментов, для проведения ферментативных реакций используют неочищен" ные люциферазу и аденилаткиназу лампочек светляков и грубоочищенную пируваткиназу из мьнп кролика, подвергнутые соиммобилиэации на бромциансефарозе при массовом соотношении лампочки светляков : пируваткинаэа : бромциансефароза 50:(3-12):

:(50-100).