Способ определения качественного состава внеклеточных протеолитических ферментов бацилл

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к определению качественного состава протеиназ, и может найти применение в микробиологической промышленности, технической микробиологии и генной инженерии при селекции штаммов, синтезирующих нужный набор внеклеточных протеиназ. Цель изобретения - сокращение времени определения состава протеиназ и упрощение известного способа, включающего . выращивание чистой культуры микроорганизмов на питательной среде, разделение вьщеляемых ферментов путем электрофореза d последующим выявлением ферментов по полосам гидролиза ii& индикаторной пластине. Выращивание бацилл ведут на молочно-агарозной среде до появления зон просветления молока, образованных первичными колониями бактерий, а электрофорез ферментов ведут из дисков среды, отобранных из зон просветления молока. Локали-i зацию ферментов выявляют на индикаторной молочно-агарозной пластине по зонам просветления молока. Для определения состава ферментов параллельно используют индикаторные пласти-, тинки с ингибиторами прбтеиназ - о-фенантролином (0,5 мг/мп), ингибитором металло-протеиназ и фенилметансульфонилфторидом (0,5 мг/мп) - ингибитором сериновых протеиназ. Предложенный способ упрощает определение состава ферментов и сокращает время определения от 3-5 сут до 5-20 ч. 1 з.п. ф-лы, 2 ил. Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

15 А1 иЯ0„„2 (51)4 С 12 N 9/52, G 01 N 27/26// (С 12 N 9/52, С 12 R 1:07) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3894991/31-13 (22) 17.05.85 .(46) 30.07.87. Бюл. Ф 28 (7 1) Институт биохимии AH ЛитССР (72) И.П.Рубикас, P.Ю.Иешкис, P.lO.Юркшайтите, P.Р.Дагите, Д.Б.Андрошюнене и Э.П.Люткявичюс (53) 577. 11(088.8) (56) Every P. Quantitative measurment of protease activities in slab

polyacrilamide ge1 electrophoregrams. - Analyt. Biochim. 1981, р. 116-519.

Жеребцов Н,А., Щебыкина Л. Б. Исследование протеолитического комплекса микромицета Phizopus pygmaus

Pl-8. — Прикладная биохимия, микробиол. 1983, 19/2/, с. 226-231. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАЧЕСТВЕННОГО

СОСТАВА ВНЕКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ

ФЕРМЕНТОВ БАЦИЛЛ (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к определению качественного состава протеиназ, и может найти применение в микробиологической промышленности, технической микробиологии и генной инженерии при селекции штаммов, синтезирующих нужный набор внеклеточиых протеиназ.

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

Цель изобретения — сокращение времени определения состава протеиназ и упро-.. щение известного способа, включающего, выращивание чистой культуры микроорганизмов на питательной среде, разделение выделяемых ферментов путем электрофореза C последующим выявлением ферментов по полосам гидрализа на индикаторной пластине. Выращивание бацилл ведут на молочно-агарозной среде до появления зон просветления молока, образованных первичными колониями бактерий, а электрофорез ферментов ведут из дисков среды, отобранных из зон просветления молока. Локализацию ферментов выявляют на индика" а торной молочно-агарозной пластине по зонам просветления молока. Для. определения состава ферментов парал- лельно используют индикаторные пласти- С . тинки с ингибиторами прбтеиназ - о-фенантролином (0,5 мг/мп)р ингибитором В металло-протеиназ и фенилметансульфонилфторидом (0,5 Mr/Më) — ингибитором сериковых протеиназ. Предложенный способ упрощает определение состава ферментов и сокращает время определения от 3-5 сут до 5-20 ч. 1 з.п. ф-лы, 2 ил.

132661

Изобретение относится к микробио-, логии, а именно к способу определения качественного состава протеолитических ферментов, и может быть применено в микробиологической промышленности, технической микробиологии и генной инженерии при селекции штаммов, синтезирующих нужный набор внеклеточньм протеиназ. 10

Цель изобретения - упрощение и сокращение времени определения состава внеклеточных протеолитических ферментов (ВПФ).

На фиг. 1 изображено разделение

° протеолитических ферментов путем электрофореза на полиакриламидном геле (ПААГ) из дисков, взятых из зоны просветления, где А — чашка Петри с молочно-агарозной средой; видны две 0 колонии с зонами просветления;. Б— аппарат электрофореза с нанесенными дисками;  — индикаторные пластинки после инкубации с ПААГ; 1 — колония бацилл; 2 — зона просветления молока; 25

3 — диск, взят из зоны просветления;

4 — разделительный ПААГ; 5 — концентрирующий ПААГ; 6 — индикаторная молочно-агарозная пластинка; 7 и 8 — зоны просветления молока на индикаторной пластинке, соответствующее месту наличия разных протеиназ в ПААГ; 9 — выявление сериновой протеиназы на индикаторной пластинке с о фенантролином;

10 — выявление металло-протеиназ на индикаторной пластинке с фенилметан35 сульфонилфторидом (ФМСФ); 1 1 — индикаторная пластинка без ингибиторов.

На фиг. 2 изображена пластинка молочной агарозы без ингибиторов, где I дорожка — протеазы Bacillus subtilis

Cgr 4; ХХ дорожка — протеазы Bacillus

thuringiensis 203; III — дорожка — отсутствуют протеазы Bacillus subtilis

SiT5 512; IV дорожка — протеазы транс45 форманта Bacillus subtilis 203.20.

При росте микроорганизмов на.молочной среде вокруг колонии образуются зоны просветления молока — знак выделения из клеток внеклеточных протео50 лнтических ферментов (ВПФ) . Из этой зоны вырезают диск и кладут в аппарат для электрофореза, и под действием электрического тока ферменты мигрируют из диска в ИААГ. Их локализация и количестко выявляются при помощи молоч55 но-агарозной пластинки: ферменты дифундируют из ПААГ в молочную агарозу и просветляют молоко. Параллельные ин5 2 дикаторные пластинки с ингибиторами позволяют. точно определить состав ферментов (фиг. 1) ..

Пример 1. КультУРУ Bacillus

subtilis, Bacillus thuringiensis . выращивают на молочно-агарозной среде (15 г агарозы, 450 мл дистиллированной воды, 150 мл обезжиренного молока) 18-22 ч. Вокруг колоний (фиг. 1, А, 1) образуются зоны просветления молока (фиг. 1, А,2) из которых вырезают диски диаметром 7 мм, толщиной 1 мм (фиг. 1, А, 3). Используют стандартный аппарат электрофореза на гелевой пластинке (фиг. 1, Б).

После полимериэации нижней разделительной части геля (фиг. 1., Б, 4) концентрация ПААГ 7Х, рН 8,9 диски размещают над разделительным гелем и заливают 2,87-ным ПААГом (рН 6,7), образуя верхнюю часть (фиг. 1, Б, 5).

Электрофорез проводят известным методом при 0 С; электродный буфер—

0,045 М трис-глинциновый, рН 8,3.

Время электрофореза 6 ч (1 ч 10 мА;

100 В и 5 ч 30 мА, 220 В); эа это время происходит достаточно четкое разделение ферментов.

Идентификацию ферментов проводят также известным методом. Пластйнку

ПЛАГ после электрофореза накладывают на индикаторную пластинку толщиной 2 мм, сделанную из молочной агарозы такого же состава, как и среда выращивания микроорганизмов для дисков (фиг. 1, В, 11). В зависимости от ожидаемого количества и активности ферментов пластинки в контакте выдерживают 15 ч при 4 С (если ожидается высокая активность) или 3 ч при

37С С (если активность невысокая).

После инкубации ПААГ пластинку снимают и она.может быть использована вторично, только необходимо увеличить экспозицию контакта. Индикаторную пластинку фиксируют 10 мин в 107-ном растворе трихлоруксусной кислоты.

Одновременно делают электрофорез из трех параллельных дисков, взятых из зоны просветления одной колонии.

Раздельные белки из одного диска служат контрольной полосой для выявления общего числа протеолитических ферментов (фиг.1, В, 11). Две другие полосы отрезают и накладывают: одну на индикаторную пластинку с ингибитором металло-протеиназ о-фенантрилином (0,5 мг/мл) для выявления сериновых

3 13 протеиназ (фиг. 1, В, 9); вторую — на индикаторную пластинку с ингибитором сериновых протеиназ фенилметансульфонилфторидом (0,5 мг/мл) для выявления металло-протеиназ (фиг.1, В, 10). Наличие ферментов определяют по зонам просветления индикаторной молочноагарозной пластинке (см. схему на фиг. 1) .

Пример 2. Сравнение состава

I протеиназ, синтезируемых клетками в отдельных колониях Bacillus subtilis Cgr 4 и Bacillus thuringiensis

203 (фиг. 2) .

Клетки Bacillus sibtilis Cgr 4 и

Васillus thuringiensis 203 выращивают на молочно-агарозной среде (15 г агарозы, 450 мл дистиллированной воды, 150 мл обезжиренного молока) 22 ч, Вокруг колоний образуются зоны просветления молока, из которых вырезают диски диаметром 7 мм и толщиной 1 мм. Используют стандартный аппарат электрофореза на гелевой пластинке.

После полимеризации нижней разделительной части геля (концентрация полиакриламида 7Х, рН 8,9), диски размещают над разделительным гелем и заливают 2,8X-HbIM ПЛАГом (pH 6,7), об разуя верхнюю часть.

Электрофорез проводят известным методом при О С; электродный буфер—

0,045 N трис-глициновый (рН 8,3).

Время электрофореза 6 ч (1 ч 10 мА и 5 ч 30 мА на пластинку).

Идентификацию ферментов проводят с помощью молочно-агарозной индикатор ной пластинки. Пластинку ПААГ после электрофореза накладывают на индикаторную пластинку толщиной 2 мм, сде ланную из молочной агарозы такого же состава, как и среда выращивания микроорганизмов. Пластинки в контакте выдерживали 4 ч при 37 С, визуально наблюдая за появлением зон просветления молока, после чего индикаторную пластинку фиксируют 10 мин в 107.-ном растворе трихлоруксусной кислоты.

Для выявления типа протеиназ (металло- или сериновые) одновременно делают электрофорез из трех параллельных дисков, взятых из зоны просветления одной колонии. IIAAI" после электрофореза разрезают и накладывают на три параллельные индикаторные .пластинки. Первая — молочно-агарозная индикаторная пластинка без ингибиторов, которая служит для выявления

50 форез дисков донора (Bacillus thuringiensis 203, фиг. 2, II дорожка) и .реципиента (Bacillus subtilis SMY 512, 5

25 всех протеиназ; вторая — молочно-агарозная индикаторная пластинка с ингибитором металло-протеиназ о-фенантролином (0,5 мг на 1 мл молочно-агарозного геля) для выявления сериновых протеиназ; третья — молочно-агарозная индикаторная пластинка с ингибитором сериковых протеиназ фенилметилсульфонилфторидом (0,5 мг на 1 мл молочноагарозного геля) для выявления металло-протеиназ. Получено, что Bacillus

subtilis Cgr 4 при росте выделяет в среду сериновые и металло-протеиназы (фиг. 2, I дорожка). Bacillus thuringiensis 203 при росте выделяет четыре различающиеся по подвижности в ПААГ протеиназы (фиг. 2, II дорожка); две металло-протеиназы дают большие зоны просветления и одна с меньшей подвижностью дает незначительную зону просветления; небольшую зону дают сериновые протеиназы, оказывающие наибольшую подвижность, H sTHM oHH QTличаются от сериковых протеиназ син- тезируемых клетками Bacillus subtilis

Cgr 4.

Пример 3. Определение экспрессии клонированного гена .металлопротеиназы Bacillus thuringiensis 203 в клетках Bacillus subtilis БИУ 512 по составу протеиназ.

ДНК Bacillus thuringiensis 203 обрабатывают рестриктазой Sau 3A до неполной рестрикции и проводят лигирование с плазмидой рМХ 39, обработанной рестриктазой ВапН 1, После лигирования проводят трансформацию Bacillus subtilis SMY 512 prot . Отбирают трансформанты, устойчивые к эритромицину (плазмидный маркер) и образующие зоны просветления на молочной среде (экспрессия клонированного гена) .

В связи с тем, что вокруг колоний трансформантов образуется слабо выраженная эона просветления, трансформанты пересеивают на молочную агарозу и из зон просветления вырезают диски и проводят электрофорез.

Электрофорез и выявление протеиназ по зонам просветления на индикаторной молочно-агарозной пластинке с применением ингибиторов протеиназ проводились аналогично примеру 1.

В качестве контроля проводят электро5 132661 фиг, 2, Ш дорожка). При электрофорезе диска трансформанта 203.20 видна зона просветления, соответствующая одной иэ металло-протеинаэ до- нора. 5

Предлагаемый способ определения состава протеолитических ферментов, выделяемых при росте клетками одной колонии микроорганизмов, по сравнению 10 с прототипом не нуждается в выращивании чистой культуры, с последующими пересевами в жидкую среду, а также выделении белковых препаратов иэ надосадочной жидкости для проведения 15 электрофореза белков и индикации протеолитических ферментов. Кроме того не требуется многостадийность приготовления проб.

Преимущество способа заключается в том, что он позволяет одновременно изучать неограниченное число первичных после трансформации, мутагенеза или генно-инженерных операций колоний,25 упрощает определение состава ферментов и сокращает время от 3-5 сут до 3-20 ч.

5 6

Формула изобретения

Способ определения качественного состава внеклеточных протеолитических ферментов бацилл, включающий выращивание микроорганизмов на питательной среде, разделение выделяемых микроорганизмами ферментов путем злектрофореза с последующим выявлением ферментов по полосам гидролиза на индикаторной пластинке, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени определения состава протеолитических ферментов, выращивание микроорганизмов проводят на молочно-агарозной среде до-образования зон просветления молока, а электрофореэ ферментов ведут из дисков среды, выделенных из зон просветления молока, образованных первичными колониями микроорганизмов, с использованием в качестве индикаторной — молочно-агарозной пластинки.

2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью определения типа протеиназ, в индикаторную пластинку вносят ингибитор металлоили сериновых протеиназ °

Составитель В.Соина

Редактор Н.Киштулинец Техред A.Кравчук Корректор М.Пожо

Заказ 3248/21 Тираж 499 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г ° Ужгород, ул.Проектная, 4