Способ получения иммобилизованной рибозофосфатизомеразы

 

Изобретение относится к технологии получения иммобилизованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, для биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретения - увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатизомеразы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключается в том, что проводят иммобилизацию данного фермента на аминоэтил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем связывание фермента осуществляют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин. Способ позволяет получить фермент с повьшенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью. (Л СлЭ to 05 05

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСГ1УБЛИН

„,SU,„,1326616

А1 (51)4 С 12 N 11/00, 9/90

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3898255/28-13 (22) 28.03.85 (46) 30.07.87. Бюл. У 28 (71) Институт физиологии и биофизики растений АН ТаджССР (72) В.В. Иванищев, И.К. Хасанов и Ю.С. Насыров (53) 577.15 (088.8) (56) Иммобилизованные ферменты. Под ред. И.В. Березина и др. М.: МГУ, 1976, т. 2, с. 312.

Snekane М. Z. allg. Microbiol.

1982,,v 22, У 8, р. 565-576 ° (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАННОИ РИБОЗОФОСФАТИЗОМЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к технологии получения иммобилиэованных ферментных препаратов. Оно может быть использовано в производстве химических реактивов, для биотехнологических целей при создании модельных систем, фиксирующих углекислоту. Цель изобретения — увеличение стабильности и удельной активности иммобилизованной рибозофосфатиэомераэы, а также ускорение процесса. Сущность способа заключается в том, что проводят иммобилизацию данного фермента на аминоэтил-целлюлозе, которую предварительно активируют глутаровым альдегидом, причем связывание фермента осуществляют в 0,008-0,012 М натрий-фосфатном буфере с рН 7,0-7,2 в течение

50-60 мин. Способ позволяет получить . g фермент с повышенной (в 2 раза) удельной активностью и стабильностью.

1

13

Изобретение относится к способам получения иммобилизованных ферментов, которые могут найти применение в производстве химических реактивов и для биотехнологических исследований.

Цель изобретения — увеличение стабильности и удельной активности иммобилиэрванной рибозофосфатиэомераэы, а также ускорение процесса.

Изобретение заключается в том, что при иммобилизации фермента на аминоэтил-целлюлозе (AE-целлюлоза) используют в качестве поперечно-сши-! вающего реагента глутаровый альдегид, оторый добавляют не к ферменту, а к носителю. Подбор условий иммобилизации (глутарового альдегида, натрийфосфатного буфера в концентрации

0,008-0,012 М с рН 7,0-7,2, времени инкубации 50-60 мин) позволяет по сравнению с известным способом в два раза увеличить удельную активность иммобилиэованного фермента, в 9 раз повысить стабильность препарата и в 4 раза ускорить процесс иммобилизации.

Способ иллюстрируется следующими примерами осуществления.

Пример 1. К 1 г АЕ-целлюлозы приливают 50 мл 0,5 í. NaOH перемешивают и через 5 мин сливают. Затем

AE-целлюлозу отмывают дистиллированной водой 8-10 раз по 50-100 мл до рН 7-8. Далее к AE-целлюлозе приливают 50 мл 0,5 í, НС1 перемешивают и через 2 мин сливают. АЕ-целлюлозу отмывают дистиллированной водой до рН 4-5 (6-8 раз по 50-100 мл). После этого к АЕ-целлюлозе приливают

50 мл 0,5 í, NaOH перемешивают и выдерживают 30 мин при комнатной температуре (18-20 С) . Затем отмывают AE-целлюлозу дистиллированной водой до нейтральной рН (10 раз по 100 мл), Далее к АЕ-целлюлозе приливают 50 мл

0,5 M натрий-фосфатного буфера с рН

7,0. Через 10 мин раствор сливают.

Активирование AE-целлюлозы проводят следующим образом.

К АЕ-целлюлозе приливают 10 мл

2,57-ного раствора глутаральдегида в

О;5 М натрий-фосфатном буфере с рН

7,0 (к 1 мл 25Х-ногб водного раствора глутаральдегида добавляют 9 мл, 0,5 М натрий-фосфатного буфера с рН

7,0) и выдерживают в течение 1 ч при комнатной .температуре при слабом периодическом встряхивании. После чего

26616 носитель промывают 10 pas дистиллированной водой (по 100 мл) для удаления избытка глутаральдегида. Отмытую

5 дистиллированной водой АЕ-целлюлозу эабуферивают 0,01 M натрий-фосфатным буфером с рН 7,0 добавлением 50 мл буфера. Буфер сливают и AE-целлюлозу еще дважды промывают новыми порциями

1ð того же буфера.

К активированной таким образом

АЕ-целлюлозе приливают 3-5 мл ферментного препарата рибозофосфатизомеразы (концентрация белка 4-10 мг/мл).

Эту смесь инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре, периодически слабо перемешивая или встряхивая. Затем раствор сливают и иммобилизованную рибозофосфатизомеразу отмывают 2-3 раза по 50 0,01 M натрий-фосфатным буфером с рН 7,0. При этом конечный буфер (которым промывают препарат)- не содержит белка, что с определяют по поглощению раствора

25 при 280 нм.

Затем иммобилизованную рибозофосфатизомераэу отмывают 2 раза по 50 мл

0,5 M раствором NaC1 в 0,01 М натрийфосфатном буфере с рН 7,0. Такая проЗр цедура позволяет определить количество фермента, ковалентно связанного с носителем. Этот способ позволяет связывать до 7-8 мг фермента на 1 г активированной АЕ-целлюлозы. При этом удельная активность иммобилизованной

35 рибоэофосфатизомеразы составляет 50607 от удельной активности исходного ферментного препарата рибозофосфат- иэомеразы. Удельная активность препа4р рата составляет 16 ед./1 мг белка.

Пример 2. Способ осуществляли как описано в примере 1, но рН буфера для иммобилизации составлял

6,5; 6,8; 7,2; 7,5. Удельная актив4 ность иммобилиэованного фермента при этих значениях рН была, равна соответственно 6, 12, 15 и 8 ед./мг белка.

Следовательно, оптимальная величина рН буфера равна 7,0-7,2.

Пример 3. Способ осуществля-ли как описано в примере 1, варьируя концентрацию буфера — 0,015; 0,012

0,008; 0,005 и 0,001 M. Удельная активность фермента в этих условиях составляла соответственно 10, 13, 14, 8 и 6 ед./мг белка, оптимальная концентрация буфера 0,08-0,012 M.

Пример 4. Способ осуществляли как описано в примере 1, варьируя

Составитель В. Муронец

Редактор Н, Киштулинец Техред А.Кравчук

Корректор В,Бутяга

Заказ 3248/21 Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Производственно-полиграфичеакое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 13266 время иммобилизации 45-70 мин. При времени инкубации 50 и 55 мин активность фермента составляет 15 ед/мг белка а при 45 и 60 и выше — 13 и

Э

16 ед./мг белка. Оптимальное время: инкубации 50-60 мин, так как увеличение длительности инкубации нецелесообразно, поскольку оно не приводит к повышению активности фермента.

Стабильность полученного препарата при хранении, определенная как время, в течение которого теряется

507 активности, составляет 60 дней (Pi = 60 дней). Время, необходимое для проведения иммобилизации 7 ч °

Таким образом, по сравнению с известным способом предлагаемый позволяет увеличить стабильность и удельную активность иммобилизованного фер- 20 мента соответственно в 9 и 2 раза, а также в 4 раза ускорить процесс иммобилизаций.

Предлагаемый способ позволяет получить-иммобилизованный ферментный

16 о препарат рибозофосфатизомеразы, пригодный для использования его npu создании модельных систем фиксации углекислоты, что имеет важное практическое значение.

Формула изобретения

Способ получения иммобилизованной рибозофосфатиэомеразы, заключающийся в иммобилизации фермента на аминоэтил-целлюлозе с помощью поперечно-. сшивающего реагента в буферном растворе и последующем отмывании несвязанного белка, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью увеличения . стабильности и удельной активности целевого продукта, а также ускорения процесса, в качестве поперечно-сшивающего реагента используют глутаровый

1 альдегид, который добавляют к аминозтил-целлюлозе до внесения фермента, а иммобилизацию проводят в 0,0080,012 М натрий-фосфатном буфере при . рН 7,0-7,2 в течение 50-60 мин.