Способ получения сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов

 

Изобретение касается производных пептидов, в частности сопряженного соединения гаптена и мурамилпептида формулы: М-ацетилмурамил-и- aлaнил-D-изoглютaминил-L-лизил LH-RH (СГМ),которое обладает биологической активностью и может быть использовано в медицине. Цель - создание активных веществ указанного класса. Синтез СГМ ведут из гормона LH-RH в кислой форме и N-ацетилмурамил-1-аланил-0-изоглютаминил-1- лизина при массовом соотношении 1:1, в водно-формамидной среде карбодиимидным методом в присутствии 1-оксибензотриазола. Выделение СГМ ведут с помощью молекулярного сита. Испытания СГМ показывают, что оно обладает высокой иммуногенной активностью на уровне соответствующего мурамшттрипептида, но при зтом проявляет более низкую пирогенность. 2 табл. СО 00 00 4;: 00 оо

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ВСЕСОЮЗН .Я

„13!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3568453/23-04 (22) 15.03.83 (31) 8204353 (32) 15.03.82 (33) FR (46) 15.08.87.Бюл. У 30 (71) Ажанс Насьональ де Валоризасьон де ля Решерш (AHBAP)(FR) (72) Франсуаз Одибер, Клод Карелли, Луи Шеди, Пьер Лефрансьер Мишель Левель и Жан 111оай (FR) (53) 547.964.407 (088.8) (56) Шредер. Э.,Любке К. Пептиды, Мир, 1967, ч.l, с.116. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОПРЯЖЕНННХ

СОЕДИНЕНИИ ГАПТЕНОВ И МУРАМИЛПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается производных пептидов, в частности сопряжен„„SU„„1331433 А 3 йв 4 С 07 К 15/14 А 61 К 37/02 ного соединения гаптена и мурамилпептида формулы: N-ацетилмурамил- аланил-0-изоглютаминил-L ëèçèë (LH-RHj (СГМ),которое обладает биологической активностью и может быть использовано в медицине. Цель создание активных веществ указанного класса. Синтез СГМ ведут иэ гормона LH-RH в кислой форме и N-ацетилмурамил-L-аланил-0-изоглютаминил-близина при массовом соотношении 1:1, в водно-формамидной среде карбодиимидным методом в присутствии 1-оксибензотриазола. Выделение СГМ ведут с помощью молекулярного сита. Испытания СГМ показывают, что оно обладает высокой иммуногенной активностью на уровне соответствующего мурамилтрипептида, но при этом проявляет более низкую пирогенность. 2 табл.

1433 2 констатируют, что 20 мг тетанического токсина было использовано. По

55

1 133

Изобретение относится к способу получения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов биологически активных соединений, которые могут найти применение в медицине °

Цель изобретения — способ получения новых сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов, обладающих иммуногенной активностью с низкой пирогенностью.

Синтез (LH-RH)-MTP.

3 мг LH-RH, взятого в кислой форме, добавляют к 242 мг хлоргидрата

N-э1ил-N — (3-метиламинпропил) -карбодиимида (ECD 1) и к 43 мг 1-оксибенэотриазола (HOBT), используя в качестве среды 0,4 мл диметилформамида (DMF) . Инкубацию проводят при магнитном перемешивании в течение

7 ч при температуре окружающей среды.

Затем к этому раствору прибавляют

3,24 мг MTP (N-ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютаминил-L-лизин),смешанного с 0,3 мл дистиллированной воды, и оставляют полученную смесь для продолжения реакции при магнитном перемешивании в течение 48 ч при температуре окружающей среды. Продукты реакции растворяют в 0,15 М растворе NaC1 и рекуперируют образовавшиеся сопряженные соединения путем фракционирования через молекулярное сито Sephadex G 10. Сопряженные соединения вымывают в мертвом объеме. Определяют содержание пептидов в мураминовой кислоте. Обнаружено, что 93X MTP вступило в реакцию сочетания. число молекул MTP относится к числу молекул LH-RH как примерно 1:1.

Синтез сопряженного соединения

MTP — тетанический (столбнячный) токсин (выполнен в качестве сравнительного примера) .

Смешивают 16 мг МТР, 0,15 мл DMF более 0,01 мл PBS с рН 7,4 (соляной раствор, тампонированный фосфатом 1, затем 300 г ЕСО 1, 1 мг НОВТ и 2 мг раствора тетанического токсина.

Смесь оставляют для протекания реакции на 15 мин при магнитном перемешивании и при температуре окружающей среды в темноте. Затем прибавляют к этой смеси 300 1.r ECD1, 1 мг НОВТ и 2 мг тетанического токсина; реакция идет еще в течение 15 мин. Эту операции повторяют 9 раз. Затем окончании реакции рекуперируют сопряженное соединение путем хроматографии на колонке Sephadex G75 в PBS.

Сопряженное соединение содержится в верхней точке промывки. Соответствующие определения тетанического токсина и МТР осуществлялись по методике FoIin u Reissig.

Иммунизация LH-RH,ñîåäèíåííb1ì с мурамилпептидом и введенным в соляной раствор или добавку (FIA) .

На 1,2,4 и 29-й день вводят подкожно 0,1 мл следующего раствора группе мышей-самцов Swiss, имеющим возраст 6 недель:

1) 50 p r LH-RH, эмульгированного в добавке compiet de Freund;

2) 50 рг LH-RH эмульгированного в FIA;

3) 8,6 рг LH-RH, сопряженного с

4,3 г MDP и эмульгированного в

FIA;

4) 50 р г LH-RH в PBS;

5) 8,6 р г LH-RH, сопряженного с

4,3 р г MDP в PBS.

Трем дополнительным группам мышей, взятых для сравнения, вводят аналогично либо FCA,ëèáî FiA, либо

PBS,Hå содержащие ни антигена, ни

МОР.

Перед испольтованием антиген (LH-RH чистый или подвергнутый сочетании ) был адсорбирован на 507.-ном

РУР (поливинилпирролидоне ) в 0,9Х

NaC1, а инкубация осуществлялась в течение 2 ч; затем смесь подвергали эмульгированию с FIA или FCA, или добавлялись к PBS.

0,1 мл соединения, содержащего

12,57.-ный РУР, вводили подкожно мышам.

На 23 и 50-й день все мьппи были здоровы, их умерщвлили, а их сыворотку собрали и объединили по группам..

Семенники мышей и семенные пузырьки анализировались, взвешивались, после чего их поместили в раствор Boin u приготовили для гистологического изучения.

Обнаружение антител анти-(LH-RH).

Антитела анти-1 Н-RH) обнаруживают следующим образом. Вводят 50 .л сыворотки, нерастворенной перед тестированием, 50 л нормальной сыворотки зайца, растворенной на 1/80-ю в

13314

PBS, и 10 р л (LH-RH),ïoìå÷åííîãî йодом 125 приблизительно 10 000 рас— падок в минуту: dpm) . ИНкубация протекала в течение 72 ч при 4 С. Затем добавляли 150 р и суспенэии, охлажденной на льду, активного угля, покрытого декстраном (полученной при добавлении 250 мг активного угля в 100 мл раствора декстрана в 0,01 M растворе PBS). Смесь оставляют при 10 о

4 С в течение 5 мин. После центрифугирования, осуществляемого при

2500 об /мин в течение 20 мин, вещество, оказавшееся на поверхности смеси, декантируют и определяют его радиоактивность по методу Хабер. Предварительное изучение показывает, что уголь, покрытый декстраном, может адсорбировать до 95 -ного (LH-RH) чистого в указанных условиях. 20

Обнаружение антител анти-МТР.

Контролируют присутствие антител анти-ЧТР с помощью гемолитического теста, осуществляемого на пластинах микродозирующих, имеющих углубления в виде у (Cooke Engenering), следующим образом: сыворотку разрушают путем инактивации в течение 30 мин при

56 С. 50 у.л сыворотки, прошедшей двойное разбавление, смешивают с 30

50 @ л PBS. Затем в смесь вводят

20 р г сопряженного соединения све жие кровяные шарики-МТР, имеющего концентрацию 2,57, оставляют смесь для инкубации на пластинах при 37 С 35 о в течение 15 мин: наконец вводят

20 л добавления нормальной сыворотки морской свинки, разбавленной с

PBS до соотношения 1:20 и снова оставляют эту смесь для инкубации при

37 С в течение 30 мин перед тем, как заметить результаты.

Оценка пирогенности.

Опыты осуществлялись на новозеландских кроликах весом от 2,5 до

2,8 кг. Значения температуры определялись с помощью зонда с термистором, вводимого в прямую кишку кроликов на глубину примерно 8 см и соединенного с термометром модель Ф ТЕЗ, Копенгаген, Дания . Кролики содержались и наблюдались в климатической камере при 20 С. Инъекции вводились только тем животным, температура которых оставалась стабильной в течение предшествующих 30 мин. Значения температуры определялись в течение 3 ч после инжектирования композиции, пиТ а блица

Обработка

30,5

LH-RH 50,и г + FCA

LH-RH 50 >г + F!А

LH-RH 50 юг + PBS

2,5

10 (LH-RH) -MTP > г + PBS 63

При отсутствии антигена не замечают никакой фиксации в сыворотке сравниваемых животных, получивших инъекцию FCA, FIA или PBS (измеренная фиксация) по максимуму 2,37 (не является показательной 1. Однако антитела образовались, когда испольэовали змульгированный в FCA 50 р. г (LH-RH) (30,5К фиксирования ). Не отмечают показательного результата в группе животных, получивших 50 r (LH-RH) в FIА (фиксация 2,5Х слабый результат, полученный при использовании PBS (10X) Hå имеет смысла. Значительный результат получен при исследовании сыворотки, полученной от животных, иммунизированных сопряжением соединения МТР-(LH-RH) > несмотря на то, что это соединение содержит только 8,6 и r (LH-RH) и

4,4 р г МТР. Действие антител даже повышено, когда равное количество сопряженного соединения MTP-(LH-RH) введено в водной среде. Эти результаты указывают на то, что сопряженные соединения MTP-(LH-RH) являются оба более эффективными, чем соединение (LH-RH) с FCA, как и с FIÀ, так и с PBS.

33 4 рогенность которой изучалась. Результаты выражались по среднему измене-нию температуры (С), полученному у кролика в течение 3 ч после внутривенного введения изучаемой композиции. Минимальная доза пирогенная соответствует количеству, вызывающему повышение температуры на 0,6 С.

Опыты по иммунизации.

Результаты, указанные в табл.1, выражают отношение числа ударов в минуту (срм) поверхностного вещества к числу срм общему и умноженному на

100.

31433

Таблица 2

Доза, Обработка

0,0,0,2, О,1

0,0,0,6

0,3,0,3, 0,5

О, 0,1, 0,1

О, 0,2

Контроль PBS

Контроль LH-RH

0,2

0,86

0,4

8,6

0,1

145 (LH-RH)-MTP

0,1

0,4-0,2

5 13

Гистологический анализ.

Средний вес семенников несколько повысился (от 252 до 279 мг) в ре— зультате введения животным от 5 до

50,мг (LH-RH) в PBS. Хотя это повышение показательно (р 0,05), оно не связано с никаким гистологическим из менением. Наоборот то же количество антигенов, внеденных в FCA, вызывает существенное увеличение веса семенников при снижении выработки спермы и атрофии семенных каналон в некоторых случаях. И наоборот, у животных, получивших сопряженное соединение

MTP-(LH-RH) взятое в растворе в PBS, вес семенников более низкий (р 0,01) чем у животных из других групп. Более того гистологический анализ семенников показал, что только в этой группе животных наблюдают атрофию, отметившую сразу интерстициальные клетки и семенные каналы, которые были практически лишены герминатинных клеток, что отмечено у 9 мьппей из 10.

Определение антител анти-MTP.

Те же сыворотки объединили, что были использованы при определении активности к фиксированию .125 1 LH-RH также были изучены по содержанию антител анти-MTP с помощью гемолитического теста с сопряженными соединениями красных кровяных шариков и MTP. Сыворотка кролика анти-МТР, полученная после гипериммунизации, осуществленной с сопряженным соединением альфа-метиловый сложный эфирМТР и сыворотка альбуминная быка, использовалась н качестве сравнительного антигена. Тогда как констатируя реакции гемолиза н сыворотке анти-MTP кролика до конечного растворения 1:30.720, не отмечают никаких антител анти-МТР ни в одной группе животных, обработанных сопряженным соединением MTP-(LH-RH).

Обнаружение возможной пирогенности изучаемых сопряженных соединений со сравниваемыми молекулами. !

О Результаты, приведенные н табл.2, указывают на отсутствие пирогенности у предлагаемых соединений по сравнению с пирогенностью либо самого мурамилпептида, когда он находится в выделенном состоянии, либо сопряженного соединения, которое тот же мурамилпептид может образовать с естестненным антигеном, например с тетаническим токсином. Сопряженное

20 предлагаемое соединение ((LH-RH)-MTP) не вызывает значительного повьппения температуры у животного, даже когда относительная доза MTP в сопряженном соединении составляет примерно

9,3 р г МТР. Эти результаты сравнимы с результатами, полученными в тех же условиях при использовании сравнительных сопряженных соединений (ТТ-MTP), вызывающих значительное повышение температуры, даже когда относительное содержание MTP в сопряженном соединении, введенном животному, н 1 00 раз .ниже, чем количество предлагаемого соединения.

35 Кроме того, более высокие дозы сопряженного соединения (LH-RH)-МТР, включающего относительное количество н 77 г МТР, не вызывает у животного отмеченного повьппения темпера40

1331433

Продолжение табл.2

0,1

О, 0,2

0,1, 0,1, 0,6

0,1, 0,3, 0,7

0,2

0,4

0,3

0,3

1,2

1,1, 1,3

МТР

Знак " " относится к сочетанию в исследуемых сопряженных соединениях между относительными дозами в этих сопряженных соединениях, с одной стороны,с гормоном, а с другой стороны, с МТР.

Составитель В.Волкова

Редактор А.Долинич Техред М.Ходанич Корректор С.Черни

Заказ 3596/58 Тираж 347

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 1,2 0,6

3,4,-1,8

17,2,9,3

86-46

Полученные результаты свидетельствуют о низкой пирогенности полученного предлагаемым способом сопряженного соединения гаптена с мурамилпептидом: (LH-RH) -N-ацетилмурамил-1аланил-О-изоглютаминил-L-лиэил.

Формула изобретения

Способ получения сопряженных соединений гаптенов и мурамилпептидов общей формулы: М-ацетилмурамил-1аланил-О-иэоглютаминил-L-лиэил

tLH RH1, заключающийся в том, что

25 гормон LH-RH в кислой форме вводят во взаимодействие с N-ацетилмурамилL-аланил-О-иэоглютаминил- -лизилом при массовом соотношении 1:1 в водно-формамидной среде карбодиимидньи методом в присутствии 1-оксибенэотриаэола с последующим выделением целевого продукта на молекулярном, сите.