Способ определения @ -токоферола

 

Изобретение относится к химическим методам определения -токоферола с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТСХ), и может быть использовано в сельскохозяйственных, медицинских и фармацевтических лабораториях при определении содержания : -токоферола и синтетических антиокислителей фенольного ряда, а также саитохина и дилудина в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях животных, а также для контроля производства витамина Е и синтетических антиокислителей. Цель изобретения - повышение чувствительности способа определения о(-токоферола. Способ заключается в щелочном омылении образцов , экстракции неомыляемой части гексаном, тонкоелойнохроматографическом разделении, проведении цветг ной реакции непосредственно на пластинке , элюировании цветного комплекса с пластинки и фотометрированш элюата. Проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железоаммонийных квасцов, высушивания и обработки их раствором батофенантролина с последующим злюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью, содержащей фосфорную кислоту, серную кислоту и метанол при следующем соотношении компонентов , об.%: фосфорная.кислота 5-7 серная кислота 0,1-0,3, метанол - остальное. 2 табл.. С «б (Л со со ГчЭ tsD ГО оо

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1332223 (5D 4 G 01 N 30/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 4058471/31-13 (22) 10.03.86 (46) 23.08.87, Бюл. 9 31 (71) Украинский научно-исследовательский институт птицеводства (72) П,Ф,Сурай и M,Ñ,Æåäåê (53) 543.54.42 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

У 974262, кл, G 01 И 30/94, 1986, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ с1-ТОКОФЕРОЛА (57) Изобретение относится к химическим методам определения -токоферола с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматографии (ТСХ), и может быть использовано в сельскохозяйственных, медицинских и фармацевтических лабораториях при определении содержания

4-токоферола и синтетических антиокислителей фенольного ряда, а также сантохина и дилудина в кормах, пищевых продуктах, в органах и тканях животных, а также для контроля производства витамина Е и синтетических антиокислителей, Цель изобретения повышение чувствительности способа определения (— токоферола ° Способ заключается в щелочном омылении образцов, экстракции неомыляемой части

rексаном, тонкослойнохроматографическом разделении, проведении цвет; ной реакции непосредственно на пластинке, элюировании цветного комплекса с пластинки и фотометрировании элюата, Проявление пластинок проводят путем их обработки раствором желеэоаммонийных квасцов, высушивания и обработки их раствором батофенантролина с последующим элюированием окрашенного адсорбированного слоя смесью, содержащей фосфорную кислоту, серную кислоту и метанол при следующем соотношении компонентов, об.7: фосфорная. кислота 5-7 серная кислота 0,1-0,3, метанол остальное, 2 табл, 1 1332223 2

Изобретение относится к химическим методам. определения витаминов группы Е (токоферолов) с применением хроматографических методов очистки, в частности тонкослойной хроматогр афии (ТСХ) .

Способ заключает ся в том, что проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железоаммоний- 10 ных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина„ а в качестве элюента используют смесь, состоящую из фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при следующем 15

I соотношении компонентов, об.%:

Фосфорная кислота 5-7

Серная кислота 0,1-0,3

Метанол Остальное

Наиболее существенными отличитель- 20 ными признаками предлагаемого способа являются следующие °

1, Проявление пластинок проводят путем их обработки раствором железо-аммонийных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантро— лина, 2, В качестве элюента используют смесь, состоящую иэ фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола при 30 следующем соотношении компонентов, об,Е:

Фосфорная кислота 5-7

Серная кислота 0,1-0,3

Метанол Остальное 35

Предлагаемый способ позволяет вдвое повысить чувствительность определений и дает возможность определять синтетические антиокислители фенольного ряда, сантохин и дилудин, 40

Определение витамина Е проводят следующим образом, Пример 1 ° Определение витамина Е в желтке куриных яиц, Навеску желтка куриного яйца 45 (0,1-0,2 r) переносят в колбочку для омыления, добавляют 50 мл этанола, 100 мг пирогаллола и 2 г гранулированного едкого натра, присоединяют обратный холодильник и омыляют на 50 о глицериновой бане 20 мин при 90 — 95 С, Затем охлаждают и трижды экстрагируют неомыляемую фракцию гексаном порциями по 50 мл, Затем гексановый экстракт отмывают до нейтральной реакции по универсальной индикатор— ной бумажке, высушивают безводным сульфатом натрия и выпаривают в токе азота на роторном испарителе, Далее сухой остаток растворяют в 0,2 мл хлороформа и количественно переносят на стартовую линию хроматографической пластинки в виде полосы длиною

80 мм, Рядом наносят свидетель примерно 0,5-1 мкг cL — токоферола, Хроматографическое разделение токоферолов на подготовленных пластинках осуществляют в камере, насыщенной парами хлороформа, через которую в течение 15 мин продувают азот.

Когда фронт растворителя приблизится к верхнему краю пластинки, необходимо извлечь ее из камеры и высушить в токе азота при 35-40 С, о

Затем обильно опрыскивают пластинку

0,57-ным раствором железоаммонийных квасцов в этаноле, высушивают в токе теплого воздуха и опрыскивают 0,5Хным растворам батофенантролина в

I этаноле.

Обработанную пластинку выдерживают в горизонтальном положении 35 мин. При этом образуется розовокрасное пятно витамина Е на белом бе сцветном: фоне пластинки, Затем подсушивают пластинку при 20-25 С, определяют локализацию Ы вЂ” токоферола по свидетелю и количественно переносят окрашенный участок адсорбента в пробирку с притертой пробкой, Затем в пробирку приливают 3 мл элюирующей смеси, "oñòàÿùåé из метанола, фосфорной и- серной кислот в объемном соотношении 93,8:6:0,2, энергично встряхивают 1 5-20 си фильтруют через обеззоленный фильтр (красная лента)., Сполоснув пробирку 1 мл этой же смеси, переносят ее на тот же фильтр, Полученный розовый фильтрат фотометрируют при 492 нм по сравнению с элюирующей смесью, Содержание витамина Е рассчитывают по калибровочному графику, построенному по ol -токоферолу, Пример 2, Определение изомеров витамина F. в травяной муке из люцерны, Навеску травяной муки 0,05 — 0,1 г омыляют спиртовой щелочью и дальнейшие операции проводят так же, как описано в примере 1, По окончании хроматографии проявляют пластинки так же, как и при анализе желтка куриных яиц, Положение Ы -токоферола определяют по свидетелю, à p+ 1токоферолов — пр величине К, Все дальнейшие процедуры такие же, KRK

1332223 и при определении витамина Е в примере 1. При отсутствии специальных свидетелей допустимо определение концентрации изомеров витамина Е по калибровочному графику, построенному

5 по 1-токоферолу, Пример 3. Определение сантохина в кормах, Навеску корма (1 г) заливают

30 мл хлороформа и взбалтывают на шюттель-аппарате в течение 15.мин, Затем фильтруют через. слой безводного сульфата натрия. Корм дважды промывают по !О мл хлороформа и переносят на ту же воронку с сульфатом натрия, Затем полученный экстракт упаривают на роторном испарителе до-. суха и растворяют в 1 мл хлороформа, На стартовую линию хроматографической пластинки наносят 0,05 мл полу- ченного раствора в виде полосы длиной 60-80 мм, рядом наносят в виде точки свидетель — 0,01 мл раствора сантохина в хлороформе (100 мкг/мл). 25

ТСХ проводят в камере, насыщенной парами хлороформа. После того, как фронт растворителя поднимется по пластинке доверху, ее извлекают Нз камеры, подсушивают и далее обрабаты- З0 вают, как описано в примере 1, Сантохин проявляется в виде розово-красного пятна на белом фоне. Далее окрашенный участок силикагеля соскабли— вают и обрабатывают, как описано в примере 1, Содержание сантохина в корме определяют по калибровочному графику, Пример 4„ Определение сантохина в премиксе, 40

Осуществляют так же, как в примере 3, но после экстракции полученный раствор не упаривают, а в мерной колбе доводят хлороформом до 100 мл, Из них 0,05 мл наносят на стартовую 45 линию хроматографической пластинки и обрабатывают, как описано в примере 3, Пример 5, Определение дилудина в корме, 50

Осуществляют так же, как в примере 3, но на хроматографическую плас, тинку наносят О, 1 мл полученного раствора, Хроматограмму проявляют, как и в пРимере 1, но розово-красное пятно дилудина появляется на пластинке не сразу, а через 3-5 мин после опрыскивания хроматограммы раствором батофенантролина, Все последующие операции проводят аналогично примеру 3.

Пример. 6, Определяют витамин

Е в желтке яиц, как описано в примере 1, но используют элюирующую смесь с различным соотношением фосфорной кислоты, серной кислоты и метанола, Определение оптимального состава элюирующей смеси при определении витамина Е и синтетических антиокислителей показано в табл,1, 1

Полученные данные позволяют заключить, что допустимым соотношением компонентов в элюирующей смеси являют ся:

Фо сфорная кислота 5-7

Серная кислота 0,1-0,3

Метанол Остальное

При исполь зов анни р азр аб от анной элюирующей смеси достигается количественное элюирование цветного комплекса, образованного батофенантролином и железоаммонийными квасцами под воздействием витамина E или синтетических антиокислителей, При использовании цветной элюирующей смеси цветной комплекс элюируется с . пластинки не полностью, Экспериментально также установлено, что использование в составе элюирующей смеси других спиртов (этанол, бутанол, пропанол и др,), взамен метанола не ! позволяет полностью элюировать цветной комплекс, Кроме того, использование серной кислоты в количествах меньше 0,1 об. . также значительно снижает эффективность элюирующей смеси, а увеличение ее количества s элюенте более 0,3 об.% также нецелесообразно, так как значительно повышается кислотность среды и устойчивость окраски раствора снижается.

Замена серной жислоты соляной или другими минеральными кислотами также приводит к снижению эффективности элюирующей смеси.

Орто-фосфорная кислота введена в состав элюирующей смеси в качестве стабилизатора окраски. Оптимальным ее количеством в элюирующей смеси является 6 об,, Поскольку при уменьщении ее количества ниже 5 об. . или при увеличении более 7 об..% стабильность окраски элюата падает, то до» ., пустимыми пределами использования фосфорной кислоты в элюирующей смеси является 5-7 об, .!

332223 антиокислителей позволяет использовать предлагаемый способ как для анализа органов и тканей животных, так и для определения синтетических антиокислителей в кормах и пищевых продуктах, При проявлении пластинок путем их обработки раствором железоаммонийных квасцов, высушивания и обработки раствором батофенантролина чувствительность способа повышается в 2 раза, При этом, за счет того, что фон практически всегда остается бесцветным, повышается точность определений.

При замене железоаммонийных квасцов на другие соли трехвалентного железа, например на хлорид железа, после опрыскивания пластинка становится желтовато-красного цвета, Это объясняется присутствием в солях трехвалентного железа следовых количеств

Fe2, особенно в старых реактивах

2+ после их хранения, На этом фоне железо аммонийные квасцы являются солью, где практически отсуствуют ионы Fe что дает возможность ис2Ф пользовать эту соль в смеси с батофенантролином в качестве цветореагента при определении витамина Е и синтетических антиокислителей, / !

И споль зо в ание элюирующей сме си, полученной известным способом, дпя элюирования цветного комплекса Fe

2+ с батофенантролином невозможно, так как окраска извлекается не полностью, а на 50-60%, Предлагаемый элюент из - влекает цветной комплекс количеств енно.

о р м у л а и з о б р е т е н и я

Способ определения -токоферола, предусматривающий омыление анализируемой пробы в присутствии пирогаллола при 90-95 С, экстракцию эфиром неомыляемой части пробы, высушивание эфирного экстракта, выпаривание и растворение полученного остатка в хлороформе с последующим тонкослойным хроматографическим разделением полученного раствора путем нанесения его на хроматографичсскую пластинку, элюирование адсорбированного слоя. смесью, содержащей спирт и неорганическую кислоту, проявление пластинок обработкой их цветореагентом и фотометрирование элюента, о т л и ч а ю— хина, дилудина и синтетических антиокислителей фенольного ряда (БОА и

БОТ) с высокой точностью и хорошей воспроизводимостью результатов, Возможность селективного определения токоферолов и синтетических

П .р и м е р 7. Определяют витамин Е и синтетические антиокислители в корме предлагаемым способом, Аналогично проводят анализ этого же

5 образца известным способом. С этой целью отбирают 1 кг измельченной пшеницы, в которую вводят по 10 мг

g-токоферил-ацетата, сантохина, дилудина, бутилоксианизола (БОА) и бути- 1п локситолуола (БОТ), При этом витамин

Е и синтетические окислители сначала растворяют в 100 мл хлороформа и пульверизатором распыляют на измельченную пшеницу, одновременно переме — 15 шивая ее, Затем увлажненную хлороформом пшеницу просушивают в вытяжном шкафу до полного удаления запаха хлороформа, После этого отбирают по 1 г измельченной пшеницы для определения витамина Е и для определения синтетических антиокислителей, Определение витамина Е проводят аналогично примеру 1, Синтетические .антиокиспители определяют аналогично 25 примеру 3, При этом рядом с полоской экстракта на пластинку наносят в виде точек метчики — по 1 мкг сантохина, дилудина, БОТ и БОА, После окончания хроматографии цветную реакцию на ЗО пластинке проводят аналогично приме— ру 1. На пластинке сначала появляются розово-красные пятна сантохина и БОА, через 3-5 мин полностью прояв— ляется дилудин а еще через 5-7 мин—

9 35 розово-красное пятно БОТ, Все даль— нейшие операции проводят, как описано .в примере 1, а содержание p(-токоферола и синтетических антиокислителей определяют по калибровочным 40 графикам, Сравнительная характеристика предлагаемого и известного спо— собов при определении витамина Е и синтетических антиокислителей в кор мах представлена в табл,2, Таким образом, при сравнении обоих способов выявлено, что предлагаемый способ определения витаминов группы F. значительно превосходит из— вестный как па чувствительности, так и по точности определений, При этом предлагаемый способ дает возможность количественного определения санто3 8 в качестве неорганической кислоты фосфорную кислоту и серную кислоту, а в качестве спирта — метанол при следующем соотношении компонентов, об.7:

133222 шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, проявление пластинок ведут путем обработки их сначала раствором железо5 аммонийных квасцов в этаноле с последующим высушиванием, затем раствором батофенантролина в этаноле, а элюирование окрашенного адсорбированного слоя осуществляют смесью, содержащей

5-7

0,1-0,3

0 ст аль но е

Фосфорная кислота

Серная кислота

Метанол

Таблица!

Содернвние компонентов в алвирующей смеси

Компонент

5 6

Фосфорная кислота О

Серная кислота 0,2 0,2

0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 О 2

99,8 98, 8 97,8 96, 8 95, 8 94,8 93,8 92,8 92, 8 90, 8 89,8

Метанол

Определено

Ю "токофе роля, Х 60, О

99р5 97,! 95,0 93,2

80,0 86,4 92 О 96,! 99,8 l00

Фосфорная кислота 6 6

6 6

0el5 О ° 20 О ° 25 0 ° 30 Ое35 О ° 40 О ° 45 Ое50

0,05 О,!

Серная кислота О

93,95 93,90 93,85 93,80 93 75 93,70 93,65 93,60 93т55 93,50

97, 2 99, 7 99, 8 l00 99, 9 99, 8 98,0 96,9 95, 94,0

94,0

Метанол

Определено с(-токоферолв, 2 84,6

Величина R!

s хлороформе

Найдено, Х

Добавлено, мкг

Количество

g -токоферола в 1 r корма +

Предлагае!ый способ

60 0,64

40 0,43

60 0,18

50 Ор29 .

60 Ов52

10 98,4 0,5

lO 97 6 0 2 сантохина

96,9 3

10 днлу дина

98,8

БОА

97,3 4

Известный способ

16 15 0,14 ef-токоферилацетата 10 96 0 2

60 0,63

40 . 0,42

100 0,19

l0 83 1 5 сант охина дилудина

10 54,0 20

10 58р0 15

10 41т3 30

БОА

40 0,28., 80 Ов52

БОТ

1 — количество определений равно 6, 18,24 4 0,06 б1"токофернлацетата

i