Способ получения иммобилизованной люциферазы светляков

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы светляков. Цель изобретения - повышение удельной активности и стабильности препарата. Инкубирование люциферазы в смеси с носителем ведут в буферном растворе с ионной силой от 0,3 до 0,8, при этом активность люциферазы в растворе составляет от 0,2-10® до 20-10 мВ/мл. Носитель предварительно обрабатывают в течение 0,2 - 1,0 ч лецитином или сфингомиелином, или холестерином, или стеариновой кислотой, или смесью липидов, выделенной из лампочек светляков . Используют 0,1 М трис-ацетат- . ный буферный раствор с рН 7,8, содержащий 0,3-0,8 И КС1, 15-25% глицерина , 0,8-1,2 мг/мл дитиотрейтола. 3 з.п. ф-лы. 1 табл. i (Л со 4 оо со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) 41189 А i (51) 4 С 12 N 11/12, 11/14

ВСЕС01(БАЧКИ !

13,", ... ";„13 вИБЛИОТИ4

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4017259/31 — 13 (22) 23. 01, 86 (46) 30,09,87, Бюл. № 36 (71) МГУ им. N.Â, Ломоносова (72) А.Ф, Духович, Н.И. Угарова, Н,Ю. Филиппова, С.В. Швец и И.В. Березин (53) 577-15(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 660378, кл, С 12 N 9/02, 1977.

Авторское свидетельство СССР № 987976, кл. С 12 N 9/02, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАН

НОЙ ЛЮЦИФЕРАЗЫ СВЕТЛЯКОВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу получения иммобилизованной люциферазы светляков. Цель изооретения — повы шение удельной активности и стабильности препарата, Инкубирование люциферазы в смеси с носителем ведут в буферном растворе с ионной силой от

0,3 до 0,8, при этом активность люциферазы в растворе составляет от

0,2 108 до 20 10 8 мВ/мл. Носитель предварительно обрабатывают в течение 0,2 — 1,0 ч лецитином или сфингомиелином, или холестерином, или стеариновой кислотой, или смесью липидов, выделенной из лампочек светляков. Используют О, 1 M трис-ацетат. ный буферный раствор с рН 7,8, содержащий 0,3-0,8 М КС1, 15-257. глицерина, 0,8-1,2 мг/мл дитиотрейтола.

3 з.п ° ф-лы. 1 табл.

1189

134

Изобретение относится к биотехно-, логии, а именно к способу получения иммобилиэованной люциферазы светляков.

Цель изобретения — повышение удельной активности и стабильности препарата.

Способ осуществляют следующим образом.

В качестве носителей для иммобилизации используют гидрофильные носители, которые хорошо адсорбируют липиды (фосфо- или нейтральные липиды); а именно мембраны на основе производных целлюлозы: ацетил-, нитро- или тринитроцеллюлозу; или кремнеземные носители, например силикагель, силохром. Иммобилизацию люциферазы осуществляют путем физической адсорбции фермента из буферного раствора на носителе, предварительно обработанном липидом. В качестве липидов могут быть использованы разнообразные липиды: фосфолипиды или . нейтральные липиды, например лецитин, сфингомиелин, холестерин, стеариновая кислота, а также, сложные смеси природных липидов, например смесь, выделенную экстракцией из лампочек светляков, которая кроме вьппеназванных липидов включает монофосфатидилинозит,.лизофосфатидилхолин, фосфатидилглицерин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидную кислоту, высшие жирные кислоты, их триглицериды и эфиры жирных кислот и стеринов.:

Носители, предварительно не обработанные липидом, плохо адсорбируют люциферазу и при промывке фермент легко отделяется от носителя. После обработки носителя раствором липида носитель приобретает способность прочно адсорбировать большие количества люциферазы. Для такой обработки носителя навеску его погружают в раствор липида так, чтобы носитель был полностью покрыт жидкостью. Концентрация липида в используемом ра— створе составляет 1 — 157.. Использование более разбавленных растворов липидов не позволяет получать иммобилизованную люциферазу с высокой удельной активностью. Использование более концентрированных растворов липида экономически неоправдано, так как это не влияет на активность получаемого иммобилизованного фермента.

Инкубирование носителя в растворе липида в течение 0,2-1 ч оказывается достаточным для завершения процесса адсорбции липида на носителе. При более коротком времени обработки про5 цесс адсорбции не доходит до равновесия, особенно при использовании разбавленных растворов липида, а более длительная инкубация не приводит к дополнительному положительному эффекту. После инкубации носителя в растворе липида отделяют носитель от раствора любым известным методом и высушивают в токе воздуха или другого газа при комнатной температуре.

Отработанный раствор липида используют для обработки новой партии носителя. Это приводит к экономии липида.

Затем липидизированный носитель полностью погружают в раствор фермента, охлажденный до 4 С, и инкубируют при осторожном перемешивании

20 ч. Активность люциферазы в растворе составляет (0,2 — 20) 10 8 мВ/мл, При использовании растворов с меньшей

25 активностью люциферазы получают препарат с низкой удельной активностью, а использование растворов с активностью люциферазы выше чем 20 »

«10 мВ/мл не приводит к дальнейшеЗ0 му увеличению активности препарата.

Раствор фермента должен обладать ионной силой 0,3 — 0,8 моль. При использовании концентраций соли ниже

0,3 моль наблюцается ухудшение ад-, сорбции, снижение стабильности люци феразы, а увеличение концентрации выше 0,8 моль приводит к кристаллизации соли при пониженной температуре. Предпочтительным является использование 0,1 M трис-ацетатного буфера, 40 содержащего в качестве стабилизирующих добавок 15-25Z глицерина и 0,8

1,2 мг/мл дитиотрейтола. Но положительный эффект достигается и при использовании 0,1 M фосфатного буфера

45 без стабилизирующих добавок.

После инкубирования носителя в растворе фермента носитель отделяют от раствора и промывают небольшими пор50 циями буферного раствора того же состава, ито используют для приготовления раствора фермента. Отработанный раствор фермента используют для обработки новой партии носителя.

Получают препараты иммобилизованной люциферазы с удельной активностью (25-70) *10э мВ/мг носителя, что в 10 раз вьппе, чем в прототипе. Для мемб— ран, содержащих иммобилизованную лю1341

40 циферазу, активность в расчете на

1 см составляет 100 — 300 тыс мВ. В процессе иммобилизации не происходит химической модификации фермента, ко 5 торая является одной из причин уменьшения активности люциферазы при ковалентном связывании. Иммобилизация происходит за счет физической адсорбции люциферазы на липидизированном носителе, и иммобилизованная люцифераза сохраняет около 1007 активности от исходной, Получаемые препараты без лиофилизации сохраняют высокую активность в течение 10-20 дней при хранении их при 4 С, в то время как препараты люциферазы, иммобилизованной на сефарозе, в тех же условиях за 20 дней теряет 50Х активности.

Люцифераза, иммобилизованная на липидизированных мембранах, имеет в 10-50 раз более высокую активность и стабильность, чем люцифераза, иммобилизованная ковалентно на целлюлозных пленках. Поэтому люцифераза, иммобилизованная на липидизированных мембранах, хорошо пригодна для аналитического определения микроколичеств

АТФ, прячем одну и ту же пленку используют многократно. Полученную описанным способом иммобилизованную люциферазу используют для определения

АТФ. Предел обнаружения АТФ составляет 10 "M.

Изобретение поясняется следующи- 35 ми примерами, Пример 1 ° Нитроцеллюлозную мембрану площадью 1,5 см погружают в 17.-ный раствор лецитина в спирте и инкубируют смесь в течение 0,2 ч, затем мембрану извлекают иэ раствора, высушивают в токе воздуха в течение

15 мин и погружают в раствор люциферазы с активностью 0,2 10 мВ/мл.Ра8 створ люциферазы готовят в 0,1 N 45 трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8,содержащем 0,3 моль КС1, 15Х глицерина, 0,8 мг/мл дитиотреитола.

Смесь инкубируют 20 ч при 4 С, Затем мембрану извлекают из раствора фер- 50 мента и промывают тремя порциями по

1 мл вышеуказанного охлажденного буферного раствора, а затем 2 порциями 0,1 M трис-ацетатного буферного раствора, рН 7,8. Для измерения активности иммобилизованной люциферазы полученную мембрану. помещают в кювету для измерения люминесценции, куда предварительно добавляют 1, 1 мл

189

0,1 М трис-ацетатного буферного ра створа, 0,1 мл 0,1 М МяБО, и 0,15 мл

0,01 мМ раствора ТАФ в том же буферном растворе. Кювету с мембраной и раствором субстратов помещают в измерительное отделение люминометра, измеряют фоновое свечение, затем добавляют 0,15 мл 1 мМ раствора люциферина в том же буферном растворе. Удельная активность полученной иммобилизованной люциферазы составляет 20

«10 мВ/мг носителя или 80 10 мВ/см мембраны при насыщающих концентрациях субстратов. Отработанные растворы липида и фермента используют многократно для обработки новых образцов мембран вплоть до полного расходования растворов липида и фермента °

Мембрану с иммобилиэованной на ней люциферазой хранят в 0,1 M трис-ацетатном буферном растворе, содержащем

0,3 моль КС1 и 0,8 мг/мл дитиотреитола, рН 7,8 при 4 С в течение 10 дней, измеряя каждый день активность люциферазы. Через 10 дней хранения мембрана сохраняет 70Х от исходной активности.

Пример 2. Нитроцеллюлозную мембрану площадью 1,5 см погружают в 107-ный раствор лецитина в спирте, инкубируют смесь в течение 0,5 ч, затем мембрану извлекают из раствора, высушивают в токе воздуха в течение

15 мин и погружают в раствор люциферазы с активностью 10 10 мВ/мл. Ра створ люцифераэы готовят в 0,1 M трис-ацетатном буферном растворе, рН

7,8, содержащем О,б моль КС1, 20 глицерина, 1 мг/мл дитиотреитола.

О

Смесь инкубируют 20 ч при 4 С. Затем мембрану извлекают из раствора и промывают так, как описано в примере 1, используя буферный раствор указанного в примере 2 состава. Далее измеряют активность иммобилизованной люциферазы, как описано в примере 1. Получают препарат иммобилизованной лю— циферазы с активностью 70.10 мВ/мг или 300 10 MB/см мембраны. Все остальные операции выполняют,,как описано в примере 1, но для хранения используют буферный раствор, содержащий

0,6 моль КС1 и 1 мг/мл дитиотреитола.

После 10 дней хранения мембрана сохраняет 907. от исходной активности.

Пример 3. Способ осуществляют согласно примеру 1, но носитель обрабатывают 15Х-ным раствором лецитина в спирте в течение 1 ч и исполь5 1341 l зуют раствор люциферазы с активностью

20 10 MB/мл в О,i М трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем

0,8 моль,КС1, 1,2 мг/мл дитиотреитола и 25% глицерина. Получают препа—

5 рат иммобилизованной люциферазы с активностью 50 10 мВ/мг или 200 "

xl0 мВ/см . Полученную мембрану хранят в О, 1 М трис-ацетатном буферном .растворе, содержащем 0,8 моль КС1 и

1,2 мг/мл дитиотреитола ° После 10 дней хранения мембрана сохраняет 90% исходной активности люциферазы.

Пример 4. 50 мг силикагеля инкубируют в 0,5 мл 10%-ного раствора лецитина в спирте в течение 20 мин, носитель затем отделяют от раствора на стеклянном фильтре и высушивают на воздухе в течение 15-20 мин. Затем

20 носитель помещают в 0,5 мл раствора люциферазы с активностью 10 10 мВ/мл в О, 1 N трис-ацетатном буферном растворе, рН 7,8, который содержит

0,6 моль КС1, 20% глицерина, 1 мг/млдитиотреитола. Смесь инкубируют в течение 20 ч при 4 С. Затем раствор фермента отделяют от носителя на стеклянном фильтре, и носитель промывают так, как описано в примере 2.

Затем приготовляют суспензию иммобилизованной люциферазы, которая содержит 2 мг носителя на 1 мл буферного раствора, состав которого указан в примере 1 при определении активности фермента. Активность иммобилизованной люциферазы определяют, как описано в примере 1, используя вместо мембраны с иммобилизованной люциферазой

0,1 мм суспензии носителя, соцержа40 щего иммобилизованную люциферазу.Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 50 10 мВ/мг носителя ° Отработанные растворы фермента и липида используют повторно для обработки новой партии носителя, 45 до полного расходования взятых объемов растворов.

89

Стеариновая кислота 30 10

Сфингомиелин 25 10

Смесь липидов 50 - 1О

Пример 6, Выполняют, как описано в примере 2, однако используют мембраны на основе тринитроцеллюлозы и ацетилцеллюлозы. При этом получают препараты иммобилизованной люциферазы с активностью и стабильностью, которые указаны в таблице.

Ацетилцеллюлоза

Активность мембраны, мВ/мг

70 1ОЯ 70 103

Остаточная активность после

10 дней хранения, %

90

2

4,25

5,75

Пример 5. Способ осуществляют согласно примеру 2, но для обработки носителя используют различные липиды или смесь липидов, выделеннуlo из лампочек светляков, При этом получают препараты с удельной активностью, которая указана ниже:

Липид Активность мембраны, мВ/мг

Холестерин . 1Оз

Используемый но- Тринитроцел ситель люлоза

Пример 7. Способ осуществляют согласно примеру 2, однако используют для иммобилизации люциферазу в

0,1 М фосфатном буферном растворе, рН 7,8, содержащем 0,6 моль КС1,Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 25 10 мВ/мг носителя, или 100 10 мВ/см мембраны.

После 10 дней хранения при 4 С мембрана сохраняет 80% активности, Пример 8. Все операции вы полняют как описано в примере 4, однако вместо силикагеля используют

50 мг силохрома. Получают препарат иммобилизованной люциферазы с активностью 30 10 мВ/мг носителя.

Пример 9, Препарат иммобилизованной люциферазы, полученный как

t описано в примере 2, используют для определения ультрамалых концентраций

АТФ. Измерения проводят, как описано в примере 1, но концентрацию АТФ в измерительной кювете изменяют от . 10 " до 10 " М. При этом получают следующие сигналы биолюминесценции:

Концентрация АТФ в Сигнал биолюмиизмеряемом раство- несценции, мВ ре, м

10- 3

10-1<

7 1341

Таким образом, при использовании полученных препаратов иммобилизованной люциферазы детектируют ультрамалые концентрации АТФ.

Пример 10. Способ осуществля5 ют согласно примеру 2. После промывания мембраны ее используют для изме- . рения биолюминесценции при концент-6 рации АТФ в измеряемом растворе 10 M. 10

Состав измеряемого раствора такой же, как указано в примере 1 для определения активности люциферазы. Показания для сигнала биолюминесценции следующие: 15

Измерения, Ф

2

20 .5

7

13

16 46

Сигнал, мВ

48

46

42

49

39

43

2. Способ по п. 1, о т л и ч а— ю шийся тем, что в качестве носителя используют кремнеземные носители или мембраны на основе нитротринитро- или ацетилцеллюлозы.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю шийся тем, что из липидов используют лецитин или сфинго35 миелин, или холестерин, или стеариновую кислоту, или смесь липидов, выделенную из лампочек светляков.

4. Способ по пп. 1 — 3, о т л ич а ю шийся тем, что использу40 ют 0,1 М трис-ацетатный буферный раствор рН 7,8 содержащий 0,3

0,8 моль КС1, 15-25Х глицерина, 0,81,,2 мг/мп дитиотрейтола.

Составитель Т, Мелентьева

Техред Л.Сердюкова Корректор С. Шекмар

Редактор Н. Хиштулинец

Тираж 499

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Мбсква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 4400/30

Подписное

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, мембрана с иммобилизованной люциферазой может быть испольэована многократно.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить активность препаратов иммобилизованной люциферазы по сравнению с известными способами в 10 раз, а стабильность — в

2 раза, сократить расход фермента за счет полного сохранения активности люциферазы после иммобилизации и за счет многократного использования мембраны с иммобнлизованной люциферазой для определения микроколичеств

189

АТФ. Благодаря высокой активности препаратов иммобилизованной люцифераэы, получаемой предлагаемым способом, предел обнаружения АТФ снижается до 10 М.

Формула изобретения

1. Способ получения иммобилизованной люцифераэы светляков, предусматриваюший инкубирование люциферазы в смеси с нерастворимым носителем в буферном растворе, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышеt ния удельной активности и стабильности препарата, инкубирование проводят в буферном растворе с ионной силой

0 3 — 0,8 моль, при этом используют гидрофильные носители, предваритель- но обработанные в течение 0,2 — 1,0 ч раствором фосфолипида или нейтрального липида, или их смесью в концентрации 1 — 157, а активность люцифераэы в растворе составляет (0,2-10)»

-10 мВ/мп.