1-( @ -d-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацил, обладающий антигерпетической активностью

Авторы патента:

ГАЛЕГОВ Г.А.

ЖУК Р.А.

C07H19/09 - с арабинозилом в качестве сахаридного радикала

C07D239/54 - связанные двойными связями или входящие в незамещенные оксигруппы

A61P31/22 - против вирусов герпеса

A61K31/7072 - содержащие две оксогруппы, непосредственно присоединенные к пиримидиновому кольцу, например уридин, уридиловая кислота, тимидин, зидовудин

A61K31/513 - содержащие оксогруппы, непосредственно связанные с гетероциклическим кольцом, например цитозин

Изобретение касается замещенных фурана, в частности 1-(/5-В-ксипофуранозил)-5-трифторметилурацила (ФМ), которьй обладает антигерпетической активностью и может быть использован в медицине. Цель - создание более активных веществ этого класса. Синтез ФМ ведут из 5-трифторметилурацила и гексаметилсилазана в присутствии диметилдихлорсилана при кипячении с последующей обработкой 1-0-ацотш1-2,3, 5-три-0-бензоил-/}-В-ксилофуранозой в присутствии SnCl. Выход 74,4%. Испытания показывают, что ФМ проявляет антигерпетическую активность в отношении штамма ВПГ-1, дефектного по тимидинкиназе, обладает более высоким химиотерапевтическим индексом, чем чдоксуридин (в 1,64 раза). 2 табл. (Л СО 4 СО 4 О

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

COLlHAËИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1:;

Ф г

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ ю (46) 23.01. 92. Бюл. Р 3 (21) 4035099/04 (22-) 19.02.86 (71) 1-й Московский медицинский институт им. И.N.Ñå÷åíoâa, Институт вирусологии им. Д.И.Ивановского и Институт органического синтеза АН

ЛатвССР (72) Г.А.Галегов, P.À.Æóê, Э.М.Казьмина, С.Н.Николаева, И.И.Федоров и В.M.Øoáóõoâ (53} 547.854.4(088.8) (56} Зидермане А,А. Фторпиримидины в химиотерапии опухолей. Рига: Зинатне, 1982, с. 11 °

De Clerg Е, "Antiviral and antilu-

mor activetes of 5-Substituted-2-йеохумЖпеа" Mets. and Find.

Exptl. Clin. Pharmacol 1980, 2(5), р. 253.

„„SU„„1341949 А1 (51)5 С 07 D 239/545, С 07 Н 19/09

А 61 К 31 /505 (54) 1-(p-D-КСИЛОФУРАНОЗИЛ)-5-ТРИФТОРМЕТИЛУРАЦИЛ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТИГЕРПЕТИЧЕСКОИ АКТИВНОСТЬЮ (57) Изобретение касается эамещенных фурана, в частности 1-(р-D-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацила (ФМ), который обладает антигерпетической активностью и может быть использован в медицине. Цель вЂ” создание более активных веществ этого класса. Синтез

ФМ ведут из 5-трифторметилурацила и гексаметилсилазана в присутствии диметилдихлорсилана при кипячении с последующей обработкой 1-0-ацстип-2,3, 5-три-0-бензоил-p-D-ксилофураноэой в присутствии SnCl 4. Выход 74,4Е. Испытания показывают, что ФМ проявляет антигерпетическую активность в отношении штамма ВПГ-1, дефектного по тимидинкиназе, обладает более высоким химиотерапевтическим индексом, чем идоксуридин (в 1,64 раза). 2 табл.

1341949

Изобретение относится к новому г производному 5-трифторметилурацила, обладающему антигерпетической активновЂ” стью, которое может найти применение в медицине.

Цель изобретения вЂ” создание нового производного 5-трифторметилурацила, обладающего более избирательным антигерпетическим действием и меньшей 10 токсичностью

Пример 1. Синтез 1-(p-D-ксилофураноэил) -5-трифторметилур ацила (I) °

Смесь 1,8 г (10 ммоль) 5-трифтор- 15 метилурацила, 8,8 мп (50 ммоль) гексаметилдисилазана и 0,2 мл диметилдихлорсилана кипятят, защищая от влаги воздуха, на масляной бане при температуре 165-170 С в течение 1,5-2 ч. 2р

Раствор упаривают в вакууме на роторном испарителе при 50-60 С и полученное бурое масло перегоняют в вакууме (т.кип. 59 C 1,5 мм рт.ст.) . К полученному 2,4-бис-триметилсилил-5- 25

-трифторметилурацилу добавляют 130 мл абсолютного дихлорэтана, 4,0 г (8,8 ммоль) 1-0-ацетил-2,3,5-три-О.-бензоил-р-D-кскпофураноэы и 1,4 мл свежеперегнанного четыреххлористого 30 олова. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре и затем нейтрализуют насыщенным раствором гидрокарбоната натрия до рН водной. фазы 8 и продолжают интенсивно перемешивать еще 1 ч. Реакционную смесь фильтруют через кизельгур, киэельгур на фильтре дважды промывают по 20 мл дихлорэтана. Органический слой отделяют, дважды промывают по

20 мл воды, сушат безводным сульфатом натрия и упаривают в вакууме при 4050 С. Получают 4,4 г (88,5%) пенообраэной массы, которую растворяют в

20 мл горячей смеси хлороформа и метанола (2:1) и по каплям прибавляют гексан до образования сильной опалесценции. Раствор оставляют на сутки о при температуре 4 С. Выпавшие мелкие кристаллы отфильтровывают, промывают небольшой порцией холодного метанола, .а затем гексаном. Выход 3,70 r (74,4%). Добавление к маточному раствору избытка гексана с последующим охлаждением позволяет получить дополнительно 0,40 г продукта.

Физико-химические характеристики

1-(2 .,3,5 -три-0-бензоил-p -D-ксилоI / фураио ил) -5-трифтормстилураиила; т.пл, 16! вЂ 1"С, Найдено, i;: (, 59,43, El 3,81, N 4,44.

С„Нг 1„И,,О,.

Вычислено, %: С 59,61, H 3,68, N 4.61.

ЯМР H-спектр (Д!1СС- D q + П1С), f

6, м.д.: El(3) 11,76 с. (1Н); бенэоильные группы и Н(6) 8,16-7,20 м. (16Н), H(1 ) б, 1 1 д . (1Н); Н(2, 3

5,84 и. (2Н), Н(4 ) 4,96 м. (1H);

H(5,5 ) 4,72 м.(2Н).

Спектрометр "BRUKER" HX-90, ФРГ.

Рабочая частота 90 МГц.

ИК-спектр (паста в вазелиновом масле), Ч, см 1; g 1725 о.с. (бензоильные группы ; 17, 1705 о.с.

1675 с. (пиримидиновое кольцо), 7,,.

1260 о.с.;,„„„д с ц 710 о.с.

Спектрометр "PERKIN-ELMER"-457

ПВЕЦИЯ. ТСХ: R) 0,65 (пластинки "Sulu+. йо1 БЧ- 254", ЧССР, этилацетат вЂ” гексан 25:30).

Дебензоилирование 1-(2,3,5-три-О-бензоил-р вЂ” D-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацила проводят одним иэ двух способов.

С и о с о б А. 1,87 г (3 ммоль)

1-(2,3,5 -три-О-бензоил-,9-D-ксилофуранозил). вЂ .5-трифторметилурацила в

100 мл абсолютного метанола насыщают, предохраняя от контакта с влагой воздуха, сухим газообразным аммиаком при температуре от О до -5 С. Колбу плотно укупоривают и оставляют на 3-4 сут в холодильнике при 2-. 4 С. Затем сероватый раствор осторожно упаривают в вакууме при 30-40 С. К полученному маслянистому остатку добавляют 25 ил, дистиллированной воды и пятикратно экстрагируют по 10 мл дихлорэтана.

Водный слои фильтруют через фильтр, смоченный дистиллированной водой, и упаривают в вакууме при 30-40 С. К полученному сиропу добавляют 5 мл бензола,, 1 мл абсолютного этанола и вновь упаривают. Операцию повторяют до тех пор, пока сироп не затвердеет в пористую пенообраэную массу. Получают 0,76 r (81 7%) неочищенного продукта, который растворяют в 5 мп сухого этилацетата, добавляют 2-3 капли гексана и оставляют на сутки при комнатной темпера;гурс . Затем к раствору с выпавшими кристаллами добавляют гексан по каплям до образования слабой опалесценции, оставляют на сутки

Ф 3 1341949 4

ЯМР Н-спектр (D О + ДСС), о, м.д

Н(6) 8,47 к. (1Н, I>q = 1,1 Гц);

Н(1 ) 5,85 с. (1Н, I g, gt = 1,5 Гц).;

Н(4 ) 4,41 м., (1Н, I 4, 4,4 Гц, I +! g = 6,1 Гц), Н(2,3 ) 4,30 м.

Н(5,5g) 4,02 и. (2Н, I 5а g$ = 12,3 Гц).

Спектрометр "ВКПКЕК"-MM-250, ФРГ.

Рабочая частота 250 МГц.

ИК-спектр (паста в вазелиновом масле), 1, см : о-и 3425 ср., 1710 о,с., 1695 о.с.,,,. 1622 ср., )/с-р 1280 с. при комнатной температуре, вновь добавляют гексан и помещают на сутки в холодильник. Полученные крупные кристаллы отфильтровывают и промывают гексаном. Выход 0,71 r (76,3Х). Сое5 динение I гигроскопично, его сушат и сохраняют в холодилЬнике, предохраняя от контакта с влагой воздуха.

С п о с о б Б. К 1 87 r (3 ммоль)

° 1-(2,3.,5 -три-О-бенэоил-в-D-ксилофураноэил)-5-трифторметилурацила до-. бавляют 1О мл абсолютного метанола и при интенсивном перемешивании медленно приливают 7 мл охлажденного 1М раствора метипата натрия в метаноле.

Через несколько минут раствор начинает густеть. Добавляют еще 25 мл абсолютного метанола и продолжают перемешивание в течение 2 ч при температуре 30-35 С. Затем реакционную смесь охлаждают, нейтрализуют добавлением "DOMEX-50" (Н ), ионообменную смолу отфильтровывают,,промывают на фильтре дважды по 5 мл метанола и 25 дистиллированной воды. Далее выделение проводят аналогично способу А.

Выход 0,57 r (61,3X). Т.пл. 163164 С.

Физико-химические характеристики 30 соединения I.

Найдено, Х: С 38,58; Н 3,54;

N 9,11.

С о Нм РзН206 °

Вычислено, : С 38,47, Н 3,55;

N 8,97.

ЯМР C-спектр (Р О + ДСС), Д, м.д.: С(4) 162,2 с., С(2) 15 1,7 с.;

С(6) 144,3;к (I с-с-с-г = 5,5 Гц);

СРЗ 123,2 к. (Т с = 270 О Гц); С(5) 4о

104,5 к. (I j с р= 31,4 Гц); С(1 )

92,9 с, С(4 ) 85,2 с., С(2 ) 81,4 с., C(3 ) 75,8 с, C(5 ) 60,6 с. - Спектрометр "BRUKER" WM-250, ФРГ. Рабочая частота 62, 89 МГц.

Спектрометl. "Р,HK IN-ELMER"-457, Швеция.

УФ-спектр (И О), Л„,,„, нм (с):

20 1{1800); 262 (9590).

Спектрометр EPS-ЗТ "HTTACHI", Япония. TGX: R g 0,42 (пластинки "Silufo1 UV-254", ЧССР, этилацетат) . Высокоэффективная жидкостная хроматография: содержание примесй не более

G,5 (силасорб С, LC, колонка: диаметр 4,6, длина 130 мм, 100Х Н О), Хроматограф "VARIAN"-8500, США.

Пример 2. Определение антигерпетической активности, цитостатического действия и влияния на синтез клеточных макромолекул 1-{р-D-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацила.

Изучение антигерпетической активности проводят в культуре клеток с использованием ВПГ-1, штамм 1, a также штамма LzG,„ (ТК ) по общепринятой методике изучения антигерпетических препаратов, в соответсгвии с которой определяют концентрацию препарата, вызьm ающую 50X вЂ” ное подавление репродукции вируса и на 50Х защищающую клетки от цитопатогенного действия (ЦПД) вируса простого герпеса.

С этой целью соединение Т изучают на антигерпетическую активность в ди" апазоне концентраций 3 1-500 мкг/мп.

В качестве модели .изучения антигерпетической активности используют культуру клеток "Vего", множественность инфекции 0,001 ТЦ ИД о/мл.

После 48 ч экспозиции инфицированных клеток в отсутствие соединения наблюдалось поражение 2/3 клеточного монослоя, вызванное развитием вирусного ЦПД. При концен грации 125 мкг/мл происходит существенное торможение репродукции вируса, выражающееся в значительной запержке ППД. Концентрация соединения I, равная 250 мкг/мл, на этот срок наблюдения по.|ностью предохраняет клетки, которые по своему внешнему виду не отличались от контрольных, то есть незараженных клеток.

На 72 ч наблюдения в отсутствие соединения I и.. еет место 100Х-ное

ЦПД, сопровождающееся разрушением клеточного монослоя. Прн концентрации соединения I 125 мкг/мл и той же экспозиции отмечается антигипусное действие, вь.ражзющееся в зз и ржке вирусного ЦПД. Однако защит» кзот.)r менее выражена по срлнн пню - "> сроком

341949 6 соединения Т, равные 125, 250, 500 и

1000 мкг/мл. При этом времени контакта в исследованном диапазоне концентраций не отмечалось подавления синтеза белка, что указывает на отсутствие или весьма неэначительное влияние соединения 1 на данный процесс.

Влияние исследуемого соединения I на синтез ДНК изучалось на культуре клеток "Vего". Использовалась общепринятая методика, основанная на измерении включения Н-тимидина в нуклеиновые кислоты.

Действие соединения 1 на синтез

РНК изучалось по измерению включения Н-уридина в клетки "Vего" по аналогичной методике.

Влияние 1-(р-D-ксилофуранозил)-5-трифторметилурацила на биосинтез нуклеиновых кислот исследовалось в концентрациях 125, 250, 500 и

1000 мкг/мл. Время контакта клеток с соединением I составля т 18 ч. Включение Н-тимидина и Н-уридина измеряется в нмоль/10 клеток.

Изучение включения меченых тимидина и уридина в клетки показывает, что соединение I начинает заметно ингиби" ровать синтез нуклеиновых кислот, начиная с концентрации 250 мкг/мл. Величины 50% вЂ .ных ингибирующих концент" раций ИД О составляют 660 и 760 мкг/

/мл для ДНК и PHK соответственно.

Результаты изучения влияния соединения I на синтеэ нуклеиновых кислот представлены в табл. 2.

5 1: наблюдения при той же концентрации.

Концентрация соединения I равная

250 мкг/мл, обладает выраженным противовирусным действием, вызывая подавление 1ЦЩ более чем íà 50%.

Таким образом, изучение антигерпетической активности 1-(р-D-ксилофураноэил) -5-трифторметилурацила показывает, что ИД„ на 48 и 72 ч наблюде- 10 ния составляют 110 и 210 мкг/мл соответственно.

Для изучения цитостатического действия соединения I использовались две линии клеток: "Vего" (культура клеток 15 почек зеленой мартышки), которая широко применяется в вирусологических исследованиях, и "Раушер/МХ" - оригинальная. Клетки засевают по 5 мл на флаконы 176 с концентрацией 1 3 х 20 х 10 и 8,0 х 10 для линий "ЕРО" и

"Раушер/МХ" соответственно. Исследуемое соединение I вводят с первой сменой среды через 6 ч после посадки клеток в концентрациях 125, 250 и 25

500 мкг/мл. Соединение I присутствует в среде постоянно. Для подсчета через

24, 72 и 120 ч клетки снимают со стекла, используя 0,5%-ный раствор трипсина, и суспендируют в 0,4%-ном раст- 30 воре трипанового синего на 3%-ном хлориде натрия. В камере Горяева подсчитывают только живые, неокрашенные клетки.

Результаты изучения цитостатичес-. кого действия 1-(р-D-ксилофураноэил)-5-трифторметилурацила (см. табл. 1) свидетельствуют, что соединение является малотоксичным. В исследованном диапазоне концентраций ингибирование 40 роста клеток. отчетливо выявляется лишь при максимальной из испытанных концентраций (500 мкг/мл) на 72 ч роста и составляет 56,7 и 39,6% от контроля для клеток линий "Vего" и "Рау- 45 шер/MX" соответственно. К 120 ч роста это различие существенно уменьшается (78,6 и 64,4%). Несмотря на отмеченное ингибирование роста, характер логарифмической фазы принципиаль- 50 но не изменяется.

Изучение влияния соединения I на синтез белка проводят по общепринятой методике, в соответствии с которой предшественником для синтеза белка служит + C-гидролизат хлореллы. Время контакта клеток с препаратом составляет 6 ч. Исслед ют концентрации

Результаты изучения антигерпетической активности, цитотоксичности и влияния на синтез клеточных макромолекул свидетельствуют о том, что сое- динение I является малотоксичным веществом, обладающим достоверным и избирательным антигерпетическим действием. Поскольку в соответствии с известной методикой эа токсическую концентрацию принимается та концентрация, при которой синтез клеточной

ДНК подавляется íà 50% то возможно оценить терапевтиЧескую широту 1-(/3-В-ксилофураноэип)-5-трифторметилурацила. ИД по подавлению синтеза ДНК составляет 660 мкгlмл, а ИД по антигерпетической активности.210 мкг/мл, и следовательно, химиотерапевтический индекс равне 3, 14.

Иэвестный структурный аналог соединения I вЂ” трифтортимидин в отличие от него не обладает избирательным ан134.1949

НО

ОН обладающий антигерпетической активностью.

Таблица,1

Цитостатическое действие 1-(р-Р-ксилофуранозил) -5-трифторметилурацила .на культуры клеток "Vего" и "Раушер/MX"

Число клеток, х 10 /мл через, ч

Концентрация соединения I, мкг/мл

Линия клеток

120 клетки клетки i X от контроля клетки 7 от контроля

"VER0" Контроль

1,80

5,10

100,0

12,60 100,0

12, 10 96,0

11,40 90,0

9,90 78,6

125

1,50

4,80

95,3

250

1,50

3,60

70,6

500

1,50

2,90

56,7 тигсрпетическпм действием, t! его антигерпетический эффект реализуется в аналогичном тесте при концентрации

0,7 мкг/мл, а подавление синтеза ДНК на 50Х при концентрации 0,01 мкг/мл.

Величина, соответствующая химиотерапевтическому индексу, для трифтортимидина равна 0,014, и его антигерпетическое действие проявляется в концентрациях, в 70 раз превышающих ток-.fp сичные для клеток . Так, трифтортимидин изменяет клеточную морфологию на

50Х при экспозиции 72 ч и концентрации 40 мкгlмл. В аналогичных условиях для достижения такого же эффекта под 15 действием соединения I требуется концентрация более 900 мкг/мп.

Соединение I обладает антигерпетическим действием в отношении штамма

ВПГ-1, дефектного по тимидинкинаэе 20 (ТК ) в концентрациях, аналогичных для исходного штамма ВИГ-1. Вирус простого герпеса (ТК ) является резистентным к известному антигерпетическому соединению 9-(2-оксиэтокси-. 25 метип)-гуанину(ациклогуаноэину).

Обработка вируса простого герпеса

1-(p-D-ксилофураноэил) -5-трифторме. тилурацилом в из уче ином диапа зоне концентраций практически не снижает 30 его инфекционности, что свидетельствует об отсутствии у вещества в .ру-, лицидного действия.

Сравнение активности (1-а-В-ксилсвЂ”

Фураноэил-5-трифторметилурацил) с иэ- 35 вестным аналогом по назначению вЂ” антигерпетическим препаратом идоксуридином (Kericig), 1-(2 вЂ .дезокси-р-Р вЂ рибофуранозил)-5-кодурацил) показывает что соединение по изобретению обладает . более высоким химиотерапевтическим индексом. Так, для идоксуридина

ИД -концентрация препарата, вызывающая 507-ное подавление репродукции вируса простого герпеса (ВПГ-1)алсос" тавляет О, 13 мкг/мл; ИД вЂ” концентрация препарата, вызывающая 50Х-ное подавление синтеза ДНК в клетках

О, 25 мкг/мл, и химиотерапевтический индекс равен 0,25/0,13=1,92. Для соединения по изобретению соответствующие ингибирующие концентрации ИД д (ВПГ-1) 210 мкг/мл; ИД, . (подавление синтеза ДНК) 660 мкг/мч, и химиотерапевтический индекс равен 660/210

3, 14.

Таким образом, соединение по изобретению обладает в 1,64 раза (3,14/

/i,92 = 1,64) большей широтой химиотерапевтического действия.

Формула изобретения

1-(B-D-Ксилофуранозил) -5-трифтоР метилурацил формулы

1341949

Продолжение табл.I

Число клеток, х10 /мл через, ч ф

24 72 клетки Й от контроля

Концентрация соединения I, икг/мл

Линия клеток

120 клетки Й от контроля клетки