Способ получения н-бутиловых эфиров производных n- ацетилмурамилпептидов

 

Изобретение касается пептидов, в частности получения N-ацетилмурамилпептидов (АП) общей формулы I сн,т АО HflV Н,ОН iUM,J) НиЛ| у НзС-СН-ОДХА/НСН СН CHj C(OJffH -C(0)ORi где X - L-аланил; L - серил; L - .валил; R - ,д-алкил нормально го или изостроения, которые могут .быть использованы в медицине для лечения инфекционных заболеваний.Цель создание новых активных пептидов, обладающих иммунорегулирующими| свойствами при низкой пирОгенности,Получение АП ведут конденсацией производного мурамиловой кислоты формулы 11 и пептида формулы I11 И ш,01(аили ру НзС-СН-С(0)ОУ CH 2CH2C(0)NH2 HX-T H-CH-aOQ-Ri где RI бензил; Y - И или - ifl-C(O) (С}{)С(0); X и R, указаны вьше, с последующим отщеплением защитных групп с помощью каталитического гидрирования в присутствии , Испытания АП Локазывают, что они проявляют кммунорегулирующее действие и противоинфекционную активность при низкой пирогенности и токсичности. I табл. СУ) со 4 Oi О О5 CrJ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Ъ|) .": К"

ОсНг

Н,ÎR Ь ИАИ P) 0

НЗС-СН-c(0)OY

СН,СН,С(0ЪН2

Нх-ын-сн-с(о)оя1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР по ДелАм изОБРеТений и ОтнРытий (21) 35! 6804/23-04 (62) 2777850/23-04 (22) 30. 11. 82 (23) 05.06.79 (31) 7816793 (32) 05.06.78 (33) FR (46) 15.10,87, Бюл. № 38 (71) Ажанс Насьональ де Валоризасьон де ля Решерш (АНВАР), (FR) (72) Пьер Лефрансье, Моник Паран, Франсуаз Одибер, Луи Шедид, Жан Шоай и Эдгар Ледере (FR) (53) 547.964.4.07 (088.8) (56) Заявка ФРГ ¹ 2728324, кл. С 07 С 1.03/52, опублик. 12.01.78. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Н-БУТИЛОВЫХ

ЭФИРОВ ПРОИЗВОДНЫХ N-АЦЕТИЛМУРАМИЛ-.

ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности получения N-ацетилмурамилпептидов (АП) общей формулы I

CH 0H н, Он aL У.ш J3

I!0 н,с-сн-с(с) х инсн(сн, сц с(о)мн,)-ufo)oR, где Х вЂ” L-аланил; L — серил; . валил; В., — С,-С„, -алкил нормально151) 4 С 07 К 9/00 А 61 К 37/02 го или изостроения, которые могут .быть использованы в медицине для лечения инфекционных заболеваний. Цель— создание новых активных пептидов, обладающих иммунорегулирующими свойствами при низкой пирогенности.1!олучение АП ведут конденсацией производного мурамиловой кислоты формулы 11 и пептида формулы 111 где R —; Y — Н или

N-С (О) (СН ) С (О); Х и R указаны выше, с последующим отщеплением защитных групп с помощью каталитического гидрирования в приСутствии

СН СООН, Испытания АП показывают, что они проявляют иммунорегулирующее действие и противоинфекционную активность при низкой пирогенности и токсичности. I табл.

1346046

Изобретение относится к способу получения ноных химических соедине— ний, конкретно н-бутиловых эфиров производных N-ацетилмурамилпептидон общей формулы

СНгОВ

Н, QH с(или 13

ИО

СНз- янс Осн

СО-Х-ЖН-CH — Ñ ÎÎÑ 1„H g — H

СНг нгСО г где R †. сукцинил, Е -аминокапроил;

Х вЂ” L-Ala, обладающих иммуностимулирующей активностью, и может найти применение в экспериментальной биологии и медицине .

Цель изобретения - разработка способа получения производных N-ацетилмурамилпептидов, обладающих высокой иммуностимулирующей активностью в сочетании с низкой пирогенностью, Поставленная цель достигается тем, что согласно предлагаемому способу защищенное производное N-ацетилмурамилпептида общей формулы

Р осн

Н,OBZI 6 ИАИ Р

СН3 — СН ЗН(-ОСНОВ

C0 — Х вЂ” NH — СН вЂ” C00(- Н8 — Н (H2CHgCONHg где Х вЂ” имеет указанное значение, Ph — фенил;

Bzl — бензил, обрабатывают 602-ной уксусной кислотой для удаления бензилиденовой защитной группы,, а затем однергают взаимодействию с янтарым ангидридом или п-нитрофениловым эфиром N-бензилоксикарбонил-с-аминокапроновой кислоты и от полученного соединения общей формулы

СНгОВ

Я,ОК d или f3 4- (.H БНСОСН3

СΠ— Х- NH — СН вЂ” СООС ь,Кд — Н

СНгСНгСОЫНг

1 где R — сукцинил, N-бензилоксикарбонил-Е-аминокапроил;

Bzl и Х имеют указанные значения, отщепляют защитные группы путем каталитического гидрогенолиза.

Изобретение иллюстрируется следую( щими примерами.

Пример 1. н-Бутиловый эфир

6-0-сукцинил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глютамина (Ia). !.1 ° н-Бутиловый эфир М,-бензил-Мацетилмурамил-L-аланил-D-глютамина (1?а) . !

0 3,634 r (5,0 ммоль) н-бутилового эфира ос -бензил-4,6-0-бензилиден-N ацетилмурамил-Ь-аланил-D-глютамина суспендируют в 250 мл 607-ной уксусной кислоты. Суспензию нагревают на !

5 кипящей водяной бане до полного растворения. Раствор фильтруют для удаления нерастворившихся частиц, фильтрат упаривают досуха ° Полученный продукт очищают на колонке с силикаге20 лем, используя в качестве элюента смесь хлороформ — метанол (6:l),фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают и лиофилизуют.

Получают 1,95 г (617) IIa;(j „ =

= +107)9 (С I; ДМФА) .

Найдено,7.: С 55,3; Н 7,0; N 7,6;

1.2. н-Бутиловый эфир о -бензил6-0-сукцинил-N-ацетилмурамил-L-аланил-Р-глутамина (?Т1а).

ЗО К раствору 638„7 мг (1,0 ммоль)

IIa в 5 мл безводного пиридина добавляют 150,1 мг (!,5 ммоль) янтарного ангидрида ° Реакционную смесь перео мешинают 24 ч при 40 С, охлаждают до о, 0 С, добавляют безводный эфир. Выпавший осадок отделяют, растворяют в метаноле с добавкой уксусной кислоты.

Раствор упаривают досуха, полученный кристаллический сироп растворяют

4О в смеси ДМФА — вода (1:1) и подверга- ют хроматографической очистке на колонке с AGI-Х-2, используя в качест— не элюента раствор уксусной кислоты в ДМФА. с градиентом 0 — 1 н. (2 х

45 х 250 мл) . Продукт элюируют О, 5 н ° раствором уксусной кислоты в ДМФА.

Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают и дважды лиофилизуют из уксусной кислоты.

Получают 659 мг (89X) IIIa;(4J =

= +67,5 (С 0,5; уксусная кислота).

Найдено,Е: С 53,3; H 6,3; N 6,8.

С Н о O,я 1 1,5 ГН СООН

Рассчитано,X: С 53,6 Н 6,8;

N 6,8.

1.3. н-Бутиловый эфир 6-0-сукцинил-N-ацетилмурамил-L-аланил-D-глютамина (Ia) .

)346046

412 мг 111а,растворенного в 25 мл ледяной уксусной кислоты, гидрируют в течение 40 ч в присутствии 200 мг

10%-ного палладия на угле. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента смесь этилацетат — пиридин — уксусная кислота — вода (6:2:0,6:I), Содержание целевого продукта во фракциях определяют с помощью тонкослойной кроматографии на пластинкак с силикагелем в системе хлороформ — метанол (2:I).

Фракции, содержащие целевой продукт, объединяют, упаривают, лиофилизуют.

Получают 269,6 мг (81 ) продукта,который растворяют в воде и хроматографируют на колонке с AG50MX2 (13 х х 1,5 см). Фракции, содержащие целевой продукт, лиофилизуют, Получают 217 мг )а; Я „ = +33 1 (С 1,0; уксусная кислота).

Найдено,X: С 28,8; H 6,6; N 8,5.

Рассчитано,%: С 28,9; Н 6,9;

N 8,5, Пример 2. н-Бутиловый эфир

6-0-Е-аминокапроил-N-ацетилмурамилL-аланил-D-глютамина (Тб).

2.1. п-Нитрофениловый эфир N-бензилоксикарбонил-Е-аминокапроновой кислоты (ZZe) .

2,653 г (10 ммоль) N-бепзилоксикарбонил-с-аминокапроновой кислоты о, растворяют при 0 С в 25 мл ацетонит рила, содержащего 1,675 r (12 ммоль) п-нитрофенола. К раствору добавляют

2,125 r (10,25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают ночь при температуре окружающей среды, затем добавляют несколько капель уксусной кислоты. Выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают, промывают ацетонитрилом, фильтрат упаривают досуха.

Остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат — гексан.

Получают 3,831 г (99X) продукта, т.пл, 62 3 С.

Найдено,X С 62,4; Н 6,0; N 7,5.

С„Н„О N

Рассчитано,X: С 62,2; Н 5,7;

N 7,3.

2,2, н-Бутиловый эфир О -бензил6-0-N-бензйлоксикарбонил-6-аминокапроил-N-ацетил-L-аланил-D-глютамина (ТТТб).

772,8 мг (2,0 ммоль) ТТб и и 638,7 мг (1,0 ммоль) ТТа растворяют в 5 мл ДМФА в присутствии 540 мг (4,0 ммоль) N-оксибензотриазола и

0,44 мл (4,0 ммоль) N-метилморфолина.

Реакционную смесь выдерживают 24 ч и упаривают досуха, Остаток растворяют в этилацетате. Раствор промывают

1р последовательно 5 -ным раствором

NaHC0 и насыщенным раствором NaC1, сушат над Ма ВО и упаривают. Остаток очищают хроматографически на колонке с силикагелем 60 /Мерк/, ис15 пользуя в качестве элюента смесь хло- роформ — метанол (1О:)), /

Получают 556,2 мг (64X) ТТТб, 2.3. н-Бутиловый эфир 6-0-Я-аминокапроил-N-ацетилмурамил-L-аланил-П2р глютамина (Тб).

556,2:мг (0,64 ммоль) ТТТб растворяют в 30 мл ледяной уксусной кислоты и гидрируют в присутствии 280 мг

5%-ного палладия на угле. Через 40 ч катализатор отфильтровывают, фильтрат лиофилизуют ° Полученный продукт растворяют в 20 мл воды, содержащей

0,7 мл 0,1 н. соляной кислоты и вновь лиофилизуют.

ЗР Получают 393,6 мг (54%) Тб,()р=

= +32,8 (С 0,5; уксусная кислота).

Найдено,X: С 47,7; Н 7,2; N 9,3;

Рассчитано,X С 47,4; Н 7,2;

З5 М 9,3.

Иммуностимулирующая активность описываемых соединений была изучена в опытах in vivo в сравнении с известным структурным аналогом - N4р ацетилмурамил-L-аланил-D-изоглютамином (МДП) .

Токсичность, Токсичность соединений Та и Тб была изучена на кроликах при парен-.

45 теральном введении, Установлено, что эти соединения в дозах до 5 мг/кг не обладают токсическим действием.

Способность вызывать лихорадку.

Изучено влияние описываемых соединений на изменение температуры у кроликов в течение Зч после ихвве дения. Соединения Ia и Тб в дозе до

5 мг/кг не вызывали значительных из55 менений температуры. Соединение Та в дозе 10 мг/кг вызывало повьппение о температуры на 0 53 С, а соединение

Тб в дозе 5 мг/кг — на 0,1-0,3 С.

Таким образом, описываемые соедине1 346046 формула изобретения

Способ получения н-бутиловых эфиран производных N-ацетилмурамилпептидав общей формулы си,оя

О

НО О Нон б Или Р

СН;СН МНСОСН, СО-Х-ИН- СН- СООС,Н,-Н

СН2 Щ ©"Н2 где R — сукцинил, а-аминокапроил; х — L-А1а1 отличающийся тем, что из н-бутилового эфира защищенного производного И-ацетилмурамилпептида общей формулы

ОСИ

Я Qgzl c unuse

М лообраэонание

2 где Х имеет указанное значение;

Ph — фенил;

Hzl — бенэил, путем обработки 607.-ной уксусной кислотой удаляют защитную бензилиденавую группу с последующей обработкой полученного соединения янтарным ангидридом или и--нитрафенилоным эфирам N-бензилоксикарбонил-E-аминакапронаной кислоты и от полученного соединения общей формулы

ый Вторичный отзыв

) 64

3,57+1, 15

Контроль

3,64

9, 54+ О, 57

2,64

8,12+0,5

Тб

3,64

8,78+1,2

О цО О Н OB71 о или Р сн,— сн нсосн>

СО Х NH СН вЂ” СООСцБ8

СН,СН2СОИН2 где R, — сукцинил, И вЂ” бенэилоксикарбонил-E-àìèíoêàïpîèë;

Х и Bzl имеют указанные значения, отщепляют защитные группы путем каталитического гидрагенолиза.

Подписное

ВНИИПИ Заказ 4935/57 Тираж 347

Произв.-полигр. пр-тие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ния практически не обладают пирогенной активностью, Иммуностимулирующая активность °

В опытах на мьппах была изучена способность соединений Ia ?б и 1"1ДП влиять на антителоабразование, В качестне антигена использовали бычий сывороточный альбумин (БСА) в дозе

500 мкг на одно животное. Группам по

8 мьппей швейцарской породы в возрасте 2 мес вводили падкожно 500 мкг

БСА с добавкой изучаемых соединений в дозе 100 мкг в изотоническом физиологическом растворе. Контрольной 1В группе вводили только БСА, Через 21 день определяли содержание антител методом пассивной гемагглютинации с использованием эритроцитов баранов, обработанных формалином (первичный 2О отзыв) ° Затем животным повторно вводили 500 мкг БСА и через 16,цней определяли содержание антител (нторичный отзыв), Полученные результаты прецставлены в таблице.

Содержание антител указано н

45 логарифмических величинах па основанию 2.

Таким образом, соединения, получаемые согласно предлагаемому способу, обладают высокой иммуностимупирующей активностью н сочетании с низкой пирогенностью.

С 4 ". СО®:Нз со-х-мн-сн-соос,н;н

CH2CH2(".ONH