Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена опейк-2

 

Изобретение относится к селекционно-генетическим исследованиям и может быть использовано при массовой оценке селекционного материала кукурузы на наличие гена Опейк-2 на различных стадиях созревания зерна. Целью изобретения является упрощение процесса выявления гена Опейк-2. Для этого после обработки образца размолотого зерна экстрагентами, получения белковой фракции и очистки от механических примесей при последующем анализе ген Опейк-2 выявляют по повьшенной активности аскартатаминтрансферазы при длине волны 500-560 нм. Обработку образца проводят при температуре 0-4 С в течение 30-60 мин. 6 табл. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А1

1« ч

*;, « «

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ ССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4109274/31-13 (22) 10,06.86 (46) 15.03.88. Бюл. Ф 10 (71) Днепропетровский государственный университет им.300-летия воссоединения Украины с Россией (72) А.Н.Винниченко, Н.П.Коцюбинская, Л.В.Комиссарова и Ю.В.Донченко (53) 575.42 (088.8) (56) Евепа, Estimation of protein

quality and quautity in corn (Zea

mays Z) by assaying protein in

two solubility fractions. - J.Agric, Foodchem, 28, р.529-532; 1980. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА КУКУРУЗЫ HA ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНА

ОПЕЙК-2

„„SU„„1381160 (5п4 С !2 Q 1/48 А 01 Н 1/06 (57) Изобретение относится к селекционно-генетическим исследованиям и момет быть использовано при массовой оценке селекционного материала кукурузы на наличие гена Опейк-2 на различных стадиях созревания зерна.

Целью изобретения является упрощение процесса выявления гена Опейк-2.

Для этого после обработки образца размолотого зерна экстрагентами, получения белковой фракции и очистки от механических примесей при последующем анализе ген Опейк-2 выявляют по повьппенной активности аскартатаминтрансферазы при длине волны

500-560 нм. Обработку образца проводят при температуре 0-4 С в течение

30-60 мин. 6 табл.

1381160

Изобретение относится к селекционно-генетическим исследованиям сельскохозяйственных культур и может быть применено при массовой оценке селекционного материала на качество белка.

Целью изобретения является упрощение способа.

Упрощение способа обеспечивается тем, что после обработки образца размолотого зерна экстрагентами и получения белковой, фракции, очистки экстракта от механических примесей в последующем анализе ген Опейк-2 выявляют по повышенной активности аспартатаминотрансферазы при длине волны 500-560 нм, причем обработку образца проводят при 0-4 С в течение 30-60 мин, а в качестве экстрагента используют дистиллированную воду.

Пример I. Предложенным способом приводится анализ активности

АСТ-азы в зрелом зерне исходных

+++А2041 +++wf9; +++w64A; +++wl55 и мутантных о,о о, А204; о о,о q

ый9;о о,о, w64A; о о,о, w155 линий кукурузы в соспоставлении с другими биохимическими критериями, характеризующими качество зерна. У всех мутантов повышенное содержание лизина и незеи!

15

25

Пример 2 ° Проводится выявле" ние гена Опейк-2 по повышенной ак" тивности АСТ-азы в разные фазы созревания зерна у исходных (+++wf9, +++A204) и гомоэиготных мутантных о,о î wf9; о о î А204 линий кукурузы. Повышенная активность АСТ-азы отмечается в зерне мутантов по отношению к исходным генотипам во все строки онтогенетического развития, что позволяет в отличие от известных способов вести более раннюю диагностику селекционного материала, 50

55 новых белков, полнопенных по амино35 кислотному составу, коррелирует с повышенной акттивностью аспартатами1 нотрансфераэы. Поэтому в этом приме-ре активность АСТ-азы может являться критерием оценки биохимических изме- 40 нений, происходящих в зерне кукурузы под действием гена Опейк-2, а следовательно, и способом выявления наличия данного гена в генотипе.

Результаты представлены в табл. 1. начиная со стадии формирования sepна.

Результаты приведены в табл.2.

Пример 3. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в первом варианте опыта в течение 15 мин, во втором

30 мин, в третьем 60 мин., в четвертом 80 мин при 4 С. Осадок во всех вариантах опыта определяют центрифугированием. В супернатанте определяют активность аспартатаминотрансферазы, Оптимальные пределы времени получения экстракта 30-60 мин. Снижение времени экстракции приводит к резкому падению активности аспартатаминотрансфераэы, а повышение удлиняет эксперимент беэ получения положительного эффекта.

Результаты опытов представлены в табл ° 3.

Пример 4. 1 г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию альбуминов в течение 30 мин в о первом варианте опыта при 4 С, во . втором при 15 С, в третьем при 25 С.

Осадок во всех вариантах опыта определяют центрифугированием, в супернатанте определяют активность АСТазы.

Наиболее высокий уровень энэиматической активности наблюдался в экстракте, полученном при 4 С.

Результаты опыта приведены в табл,4.

Пример 5. 1 r размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды и проводят экстракцию белка в течение 60 мин, при

4 С. В пробирки вносят по 1 мл субстрата АСТ и 0,2 мл кукурузного экс-. тракта, В первом варианте опыта пробы инкубируют 30 мин, во втором

60 мин, в третьем 90 мин при 37 С.

Оптимальное время инкубации пробы с субстратом 60 мин, так как в первом варианте опыта активность

АСТ-азы крайне низкая, а в третьем возрастает время опыта без достиже ния дополнительного положительного эффекта.

138! 160 ными.

Т а б л и ц а 1

Содержание лизина,X на протеин

Удельная активность АСТ-азы, ед.опт.плотности/мг белка

Отношение

Содержание неэеиновых белков,X на сухое вещество

Содержание зеин белков в 7 на сухое в -во

Линии кукурузы неэеиновых белков к + зеиновым

+++ о о,о, +++

+++ о о,о, +++ 02010K

+++ о о,о

I2,45 24,95 5,42 8,43 2,51 0,80 2,16 10,54 3,47 6,12

А204

l0:12 17,20

23,30 28,29

10,32 19,90

5,87 8,17 2,97 0,95 1,98 8,60 3,56 4,37

wf9

7е93 10э87 4в18 1э59 1в90 6э84 2 ° 24 4ю31

w64A

9,85 11,25 9,25 3,94 1,50 2,35 7,50 5,80

w155

Таблица2

18,70!

3,84

27,32

12,59

15,72

Формирование

Налив

29, 53

42,85

26,9

Молочная спелость

41; 80

41,83

31,99

51,00

Молочно-восковая

17,67

16,09

48,40

38,93

30,19 спелость

Восковая спе30,37!

6,60

10,73 лость

Зависимость активности АСТ-азы от времени инкубации представлены в табл.5.

Пример 6. г размолотого зерна кукурузы заливают 5 мл дистиллированной воды, проводят экстракцию белка в течение 1 ч при 4 С. В пробирки вносят по 1 мл субстрата

АСТ и 0,2 мл кукурузного экстракта.

После 60-минутной инкубации в пробы добавляют 1 мл 1 мМ 2,4-динитрофенилгидразина и через 10 мин 10 мл

0,4 М NaOH, Через 10 мин записывают спектр поглощения образовавшегося окрашенного комплекса в области

450-700 нм.

Обоснование граничных значений длины волны приведено в табл.6, Приведенные в табл.6 данные свидетельствуют о том, что наиболее значительные различия по активности аспартатаминотрансферазы между исходной и мутантной кукурузой наблюдается при измерениях величины оптической плотности в пределах 500560 нм. Эти пределы являются гранич!

О Формула изобретения

Способ оценки селекционного материала кукурузы на выявление гена

Опейк-2, предусматривающий обработку размолотого зерна зкстрагентами с получением белковой фракции, очистку от механических примесей и последующий анализ, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, ген Опейк-2 выявляют по повышенной активности аспартатаминтрансферазы при длине волны 500560 нм, 1381! 60

Таблица3

Активность АСТ-азы, ед,опт.плотности /мг белка

Линия

Вариант опыта по примеру 3

) хп ) I II

А 204

6,46

11,75

l 2,45

lOt I2

12,57

I0 02 wf9

6,02

9,20

Таблица4

А 204

11,75

9,10

4,07

wf9

9,20

7,03

2,97

Таблица5

30

Время инкубации,мин

Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности/мг белка

3,48

12,45 12,67

Т а б л и ц а 6

Активность АСТ-азы, ед.опт.плотности

/мг белка

Длина волны, нм аэность

oiq wf9

+++ ътй9

9,43

480

),l9

500

7,15

7,13

520

7,12

540

6,99

560

3,88

580

10,38

11 33

ll 91

12,76

16,19

10,62

17,53

I8,46

l9,03

19,75

20,07