Способ определения состояния рецепторного аппарата клеток

 

Изобретение относится к биологии . Для определения состояния рецепторного аппарата клеток рецептрры, находящиеся на поверхности клеток , связывают с транскобаламин-11- кобаламиновым комплексом, содержащим кобаламин, меченый Со. Меченые рецепторы удаляют с поверхности клеток папаином. Клетки осаждают центрифугированием; количество рецепторов нкобаламина, вступившего в клетку, определяют путем измерения радиоактивности и дальнейшего .

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (50 4 G О! N 33/50 %)

ai с

° г

С>

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

H А ВТОРСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4015388/28-14 . (22) 31.01.86 (46) 15.03.88. Бюл. Р 10 (71) Всесоюзный онкологический научный центр AMH СССР (72) Н.В. Мясищева и А.Е. Орешкин (53) 612.015(088.8) (56,) Nature, 1980, v. 288, N 5792, р. 713-715.

„„SU„„13814ОО д 1 (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОСТОЯНИЯ

РЕЦЕПТОРНОГО АППАРАТА КЛЕТОК (57) Изобретение относится к биологии. Для определения состояния рецепторного аппарата клеток рецепторы, находящиеся на поверхности клеток, связывают с транскобаламин-llкобаламиновым комплексом, содержащим

57 кобаламин, меченый Со. Меченые рецепторы удаляют с поверхности клеток папаином. Клетки осаждают центрифугированием; количество рецепторов и. кобаламипа, вступившего в клетку, определяют путем измерения радиоактивности и дальнейшего расчета.

1381400

Изобретение относится к биологии и может быть использовано в биохимии при исследовании поверхностных ре: цепторов к транскобаламин-11-кобал аминовому комплексу.

Цель изобретения состоит в, создании способа определения состояния рецепторного аппарата клеток, заключающегося в количественном определении рецейторов к транскобаламин-11 кабаламиновому комплексу при одновременном расчете суммарного количества кобаламина, поступившего в клетку за определенный промежуток времени.

Указанная цель достигается тем, что в предложенном способе рецепторы, находящиеся на поверхности клеток, связывают с транскобаламин-11- кобаламиновым комплексом, содержащим кобаламин, меченый радиоактивным Со

57

Меченые таким образом рецепторы удаляют с поверхности клеток папаином. Клетки осаждают центрифугированием, количество рецепторов и кобаламина, поступившего в клетку, определяют путем измерения - радиоактивности и дальнейшего расчета.

Hp и м е р. Для определения рецепторного аппарата клеток готовят стандартную сыворотку из богатой ! транскобаламином 11 крови кролика.

С этой целью, целлофановый мешок с сывороткой крови помещают в 7,5 М раствор гуанидин-НС1 (в соотношении

1:15) и выдерживают при комнатной температуре в течение 72 ч. По окончании процесса насыщения гуаиидином сыворотку подвергают диалиэу в течение 24 ч против 0,05 М калий-фосфатного буфера (pl- 7,5) при 4 С и замораживают.

Перед опытом приготовленную таким образом сыворотку размораживают и насыщают Со CNCbl из расчета

0,025 мкг на 1 мл, клетки суспендируют в среде 199 (не содержащей витамин В, ) и помещают в пробирку (сус6 пендирование в расчете 22,7 10 клеток на l мл среды), добавляют 0,5 мл стандартной сыворотки, инкубируют

15 мин при 37 С, вносят 4 мл охлажденной до О С среды 199 и центрифуо гируют 10 мин при 4 С при 500g. Для освобождения от иесвязавшейся радиоактивности кпетки ресуспендируют в

4 мл среды 199 и центрифугируют при тех же условиях.

Осадок клеток вновь суспендируют в 0,5 мл среды 199, добавляют 0,5 мл раствора реополиглюкина, содержащего

l2,1 мг/мл цистеина и 34,0 ед/мл папаина, инкубируют в течение 5 мин а при 37 С. Реакцию останавливают добавлением 4 мл охлажденной до О С среды 199, Пробы центрифугируют в тех же .условиях. Осадок содержит клетки, освобожденные от рецепторов, супернатант — рецепторы с транскобаламин-11-кобаламиновым комплексом, меченным по Со . Радиоактивность измеряют на 1 -счетчике. Количество рецепторов и кобаламина рассчитывают с учетом того, что одна молекула транскобаламина связывает одну молекулу кобаламина, в свою очередь один рецептор клетки связывает один транскобаламин-11-кобаламиновый комплекс.

Уровень неспецифической сорбции радиоактивного комплекса определяют путем предварительной инкубации клеток с сывороткой, насыщенной немече„— ным кобаламином и повторным инкубированием клеток со стандартной сывороткой, содержащей транскобаламин-11+СО CNCbl комплекс.

В данном примере радиоактивность супернатанта (рецепторы) — P — - составила 1400 pañï./ìèí; осадка (клетки) — l(— 1020 расп./мин; супернатанта при неспецифической сорбции (Ро )

15 расп./мин; радиоактивность 10 мкл препарата Со СИСЬ1, содержащего и.

454 10 г кобаламина, составила

125000 расп./мин, т.е. удельная радиоактивность кобаламина (Д) равна

125 е !Ф вЂ” ° 10 =2 7 10 распадов на 1 г

454 кобаламина.

В данном примере в пробу взято

22,7 10 клеток (Б). Отсюда можно

i рассчитать количество кобаламина, связавшегося с одной клеткой:

P-P -я — =2 22 10 r количество кобалД.N У ъ амина, поступившего в клетку эа

К -19

15 мин =1 63 F10 г количество

O N

Э рецепторов на одну клетку (учитывая, что I граммолекула Со CNCbl содер97 жит 6,02 10 молекул, а мол. вес

23 цианкобаламина равен 1358) — 98 рецепторов.

Таким образом, изобретение позволяет определить состояние рецепторного аппарата клеток эа счет количе1381400

Составитель А. Агуреев

Редактор Н. Швыдкая Техред М.Дидык Корректор,О. Куидрик

Заказ !! 81/40 ..Тираж 847 Подпис но е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 ственного определения рецепторов к транскобаламин-ll-кобаламиновому комплексу при одновременном расчете суммарного количества кобаламина, поступившего в клетку за определенный промежуток времени. формула изобретения

Способ определения состояния рецепторного аппарата клеток, включающий суспендирование клеток в среде

Игла или 199, инкубацию с сывороткой, содержащей транскобаламин-11-кобаламиновый комплекс, меченый по Со, отмывание путем суспендирования и центрифугирования с последующим ре- суспендированием в той же среде, добавлением к смеси реополиглюкина в объемном соотношении 1:(0,8-1,3), содержащего 34 ед./мл паланка и цистеин повторной инкубацией, центрифугированием смеси, определением уровня радиоактивности в супернатанте и осадке, по которой соответственно рассчитывают количество рецепторов и количество кобаламина, поступившего в клетку, при этом о состоянии аппарата судят по значению измеренных параметров.