Способ получения глутаматдегидрогеназы

 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технологии получения ферментных препаратов. Цель изобретения - упрощение и ускорение процесса получения глутаматдегидрогеназы, а также более полное использование сырья. Способ заключается в гомогенизации исходного растительного сьфья, в качестве которого предлагается использовать отруби ницы, получении бесклеточного экстракта и вьщелении из него мембрйнносвязанной глутаматдегидрогеназы гельхроматографией на сефарозе 2В. Полученный препарат глутаматдегидрогеназы может быть использован в связанном с мембранами состоянии или подвергнут последующему отделению с мембраны обработкой фосфолипазой в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл ферментного препарата с получением свободного фермента. Применение способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс выделения двух типов препарата глутаматдегидрогеназы. 1 з.п. ф-лы. (Л

СООЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) (51) 4 (12 М 9 06

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4103588/31-13 (22) 25.07.86 (46) 15.05.88. Бюл. В 18 (71) Институт молекулярной биологии и биохимии АН КазССР (72) М.К.Гильманов и P.Äèëüáàðêàíîâà (53) 577.15 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 958502, кл. С 12 И 9/06, 1981.

Гильманов И.К. и др. Методы очистки и изучения ферментов растений.

Алма-Ата: Наука, 1981. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛУТАИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ (57) Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к технологии получения ферментных препаратов.

Цель изобретения — упрощение и уско- рение процесса получения глутаматде». гидрогеназы, а также более полное использование сырья. Способ заключается в гомогенизации исходного растительного сырья, в качестве которого предлагается использовать отруби пшеницы, получении бесклеточного экстракта и выделении из него мембранносвязанной глутаматдегидрогеназы гельхроматографией на сефарозе 2В. Полученный препарат глутаматдегидрогеназы может быть использован в связанном с мембранами состоянии или подвергнут последующему отделению с " мембраны обработкой фосфолипазой в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл ферментного препарата с получением свобод ного фермента. Применение способа поз- р воляет значительно упростить и ускорить процесс выделения двух типов препарата глутаматдегидрогеназы. 1 з.п. ф-лы.!

395б70

И зобретение относится к биотехнологии, а конкретно к технологии получения ферментных препаратов.

Цель изобретения — упрощение и ускорение процесса получения глутаматдегидрогенаэы, а также более полного использования сырья.

Способ заключается в том, что в ,качестве исходного растительного 10, ñûðüÿ используются отруби пшеницы, из бесклеточного экстракта которых с помощью гель-хроматографии на сефарозе 2В выделяют связанную с мембранами глутаматдегидрогеназу. Глу- 15 таматдегидрогеназа может быть исполь зована в связанном с мембранами сос тоянии или подвергнута обработке фос-, фолипазой С для получения гомогенно го и свободного от фосфолипидов пре- 20 парата фермента. Получение гомогенного по белку препарата глутаматдегидрогеназы эа одну стадию хромато графической очистки приводит к упро-! щению и ускорению процесса, а выделе- 25 ! ние из одной порции исходного сырья свободной и связанной с мембранами

: глутаматдегидрогеназы позволяет комп. :лексно использовать это сырье.

Способ иллюстрируется следующими 30 примерами.

Пример 1. 100 г отрубей пше-! ницы тщательно гомогенизируют в фар .форовой ступке в 0,05 M трис-НС1 бу" фере рН 7,4, в соотношении навески отрубей к объему буфера 1:5, после чего гомогенат центрифугируют при

10000 х g в течение 10 мин. Надосадочную жидкость подвергают гель-хроматографии на колонке с сефараэой 2 В. щ

Бесклеточный экстракт разделяется на два пика. Высокомолекулярный пик содержит только мембранно-связанную глутаматдегидрогеназу в виде округлых субклеточных структур размером около l мкм. Взвешивание упаренного и освобожденного от буферных солей препарата показывает, что из 100 r отрубей получается. 47 мг мембранносвязанной глутаматдегидрогеназы в

50 расчете на белок), а общая масса мембрано-связанного фермента равна

980 мг, Эффективным спосббом освобождения глутаматдегидрогенаэы от мембран является обработка фосфолипазой С в концентрации не меньшей чем на 1 мл раствора мембранно-связанной глутаматдегидрогеназы. Освобожденная от мембран гомогенная глутаматдегидрогеназа является термостабильным ферментом (температура инактивации 80 С), что делает ее перспективной биотехнологии. Молекулярная масса глутаматдегидрогеназы, определенная при электрофорезе в присутствии додецилсульфата натрия — 55 кДа.

Пример 2, Способ осуществляют по примеру 1, но используют

0,5 мкм форсфолипазы С на 1 мл мемб— рано-связанной фракции. Получают препарат глутаматдегидрогеназы, свободной от фосфолипидов.

Пример 3. Выделение проводят по примеру 1, но используют фосфолипаэы Д или А. В обоих случаях не происходит отделения глутаматдегидрогеназы от фосфолипидов.

Пример 4. Выделение проводят по примеру 1, но используют сефадексГ-200. Мембранно-связанная глутаматдегидрогенаэа загрязняется другими высокомолекулярными продуктами.

Таким образом, использование предложенного способа позволяет значительно упростить и ускорить процесс выделения за счет исключения многостадийной хроматографической очистки препарата, а кроме того, комплексно использовать исходное сырье для выделения как свободной, так и связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы. формулаизобретения

1. Способ получения глутаматдегидрогеназы, включающий гомогениза" цию растительного сырья в буферном растворе, отделение бесклеточного экстракта и выделение из экстракта целевого продукта хроматографическими методами, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью ускорения и упрощения процесса, в качестве растительного сырья используют отруби пшеницы, а выделение глутаматдегидрогенаэы из экстракта проводят гельхроматографией на сефарозе 2В.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью более полного использования сырья, проводят обработку полученной после гельхроматографии связанной с мембранами глутаматдегидрогеназы фосфолипазой С в количестве 0,5-1 мкг на 1 мл препарата с последующим получением свободной глутаматдегидрогеназы.