Способ определения активности холестеролэстеразы

 

Изобретение относится к электрохимическим -методам анализа с использованием Лерментов и может быть использовано в промьппленности при обнаружении холестеролэстеразы в средах ее выращивания, а также в диагностических целях в медицине. Цель изобретения - упрощение способа определения активности холестеролэстеразы. Способ заключается в том, что при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом осуществляется электролиз реакционной смеси в присутствии холестеролоксидазы, платинового электрода , покрытого трехслойной мембр иой, при 0,6 В отн. Ag/AgCl электрода сравнения, а определение активности проводится по скорости увеличения анодного тока в ячейке. Способ является пригодным для анализа окрашен- ; ных, непрозрачных сред микробиологической промышленности. 3 табл. с (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУбЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А ВТОРСНОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОбРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 4105584/31-13 (22) 15,08.86 (46) 15.05.88. Бюл. Р 18 (71) Институт биохимии АН ЛитССР и

Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного (72) Г.-Г.P.Браженас, И.В.Бахматова, Л.И.Иарцинкявичене, В-.С.А.Лауринавичус, М.В.Песлякене, L .À.Êèïðèàíîâà и О.И.Бойко (53) 577 ° 15 (088.8) (56) Патент C1|JA 11 4052263, кл. С !2 D 13/00, опублик. 1977. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИХОЛЕСТЕРОЛЭСТЕРАЗЫ (57) Изобретение относится к электрохимическим -методам анализа с использованием Ферментов и может быть ис„„SU„„1395677 A 1 (51) 4 С 12 I/44 G 01 Н 27/26 пользовано в промьплленности при обнаружении холестеролэстеразы в средах ее выращивания, а также в диагностических целях в медицине. Цель изобретения — упрощение способа определения активности холестеролэстеразы.

Способ заключается в том, что при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом осуществляется электролиз реакционной смеси в присутствии холестеролоксидазы, платинового электрода, покрытого трехслойной мембр..лой, при 0,6 В отп. Ag/AgC1, электрода сравнения, а определение активности проводится по скорости увеличения анодного тока в ячейке. Способ является пригодным для анализа окрашен-: ных, непрозрачных сред микробиологи- ческой промышленности. 3 табл.

1395677

Холестерололеат + Н О холестеролэстепаза

-!. Уолестерин + Олеиновая кислота холестеролоксидаза

Холестерин + О Холестенон + Н О

Изобретение относится к электрохимическим методам анализа материалов путем измерения тока при электролизе с использованием ферментов, конкретно „. к способу определения активности холестеролэстеразы, и может быть использовано в промьппленности для определения холестеролэстеразы, а также в диагностических целях в медици- 10 . не.

Цель изобретения. — упрощение способа.

Способ предусматривает взаимодей-! ствие холестеролэстеразы с субстратом — холестернловым эфиром непредельной высшей кислоты в фосфатном ! буферном растворе в присутствии холестеролоксидазы и определение активности по величине скорости измене- 20 ния измеряемого параметра, при взаимодействии холестеролэстеразы с субстратом проводят электролиз реакционной смеси в присутствии рабочего электрода, покрытого трехслойной за- 25 щитной мембраной, при +0,6 В отн.

: Ag/AgCl электрода сравнения, а активность холестеролэстеразы определяЗлектрохимическое окисление Н О на Pt- электроде при 0,6 В отн.

Ag/AgC1 электрода сравнения генерирует анодный ток. Скорость увеличения анодного тока пропорциональна скорости образования перекиси водорода, ко- 0 торая пропорциональна скорости гидролиза холестерололеата, т,е. пропорциональна активности холестеролэстеразы. Угол кинетической кривой отражает скорость гидролиза холестерололеата.Способ осуществляют следующим образом, В измерительную ячейку, содержащую l мл буферного раствора, погружают электрод, вводят 0,02 мл холестерололеата, 0,02 мл холестеролоксидазы. Регистрируют стационарный ток в течение 0,5-1 мин, затем вводят

0„02 мл исследуемого раствора, содер55 жащего холестеролэстеразу и регйстрируют увеличение анодного тока в течение 3-4 мин, рассчитывают ферментативную активность; исходя из танют по скорости увеличения анодного тока.

В качестве рабочего электрода используют платиновый электрод, в качестве буферного раствора — 0,05 M фосфатный буфер, рН 7,0-9,0, в качестве субстрата — холестерололеат.

В интервале рН 7,0-9,0 раствора обеспечивается чувствительность измерений, а в более кислых средах. уменьшается каталитическая активность холестеролоксидазы и уменьшается чувствительность способа., Концентрация холестеролоксидазы составляет 0,33-0,5 ед/мл концентрация холестерололеата 5-10 мМ. Ниже указанных пределов концентраций наблюдается зависимость тока от концентраций холестеролоксидазы и холестерололеата, в то время как при определении ток ячейки должен полностью отражать только активность холестеролэстеразы. Использовать более высокие концентрации экономически невыгодно и нецелесообразно.

Протекают следующие превращения: ! генса угла наклона кинетической кри- вой увеличения тока в течение первых

3-4 мин. Из экспериментально полученной величины Ь Т „, нА/мин и ответа электрода на стандартную концентрацию холестерина (40 мкМ) в отсутствии холестерололеата и холестеролэстеразы вычисляют скорость ферментативной реакции (cKopocTb образова-. ния холестерина в ячейке в мкмоль/мин) и удельную активность холестеролэстеразы из трех параллельных измерений. Удельную активность препарата (Е/мг) можно вычислить также из построенного калибровочного графика (концентрация фермента — скорость ферментативной реакции). После измерения тока ячейка в течение 1,5 мин промывается буферным раствором, после чего можно проводить следующее измерение.!

Пример 1. Определение зависимости величины тока от концентрации холестеролоксидазы.

1395677

Электролиз проводят в присутствии

0,2 мМ холестерина в ячейке в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,2 и разных количеств холестеролоксидазы.

Полученные данные приведены в табл. 1.

Данные показывают, что зависимость тока от концентрации холестеролоксидазы наблюдается до 0,33 ед/мп., Пример 2. Определение зависимости величины изменения тока от концентрации холестерололеата.

Электролиз проводят в 0,05 М фосфатном буфере, рН 7,5, в присутствии

<0,5 ед/мл.холестеролоксидазы, 0,14 ед/мл холестеролэстеразы и разных количеств холестерололеата.

Данные приведены в табл. 2.

Из табл . 2 видно, что минимальная концентрация холестерололеата в ячейке должна быть 5 мМ.

II p и м е р 3. Определение активности холестеролэстеразы.

Электролиз проводят, как в примере 2, в присутствии 7 мМ холестерололеата, 0,45 ед/мл холестеролоксидазь!.

Вводятся разные объемы раствора холестеролэстеразы и записываются кинетические кривые изменения тока. 30

Для вычисления скорости ферментативной реакции устанавливают величину тока при использовании стандартного раствора холестерина (40 мкМ), которая была равна 33,3 нА. При введении в ячейку 10 мкл (20 мкг) исследуемого раствора холестеролзстеразы изменение тока составляет 5,2 нА/мин.

Из этих данных вычисляют скорость ферме тативной р ц : 40 MKM — 40

33,3 нА, х — 5,2 нА/мин. х = — 6,24 мкМ/мин (в 1 л). или. 6,24 г 10 мкмоль/мин в 1,0 мп .(в ячейке).

Следовательно, 6,24 10 ед холестеролэстеразы было в 10 мкл образ- 45 ца, а в I мп препарата было 0,624 ед. фермента. Поскольку исследуемый образец содержал 2 мг/мл белка, то удельная активность фермента, вычисленная из одного измерения, составляла 50

0,312 E/ìã. Аналогично вычислены и другие активности.

Для удобства проведения расчетов при непрерывном анализе большого количества проб используют формулу а Ъ.

A ед/мл = k — — 1

1000 где k - коэффициент, .равный концентрации холестерина, мкМ, которая с по со б с тву ет изменению тока в ячейке 1 нА; а — измеренное изменение тока, нА/мин;

Ъ вЂ” степень разбавления исследуемого образна, раз.

Например, при введении в ячейку

10 мкл исследуемой холестеролэстеразы получают

40 мкМ вЂ” 1 2 а = 5,2.нА/мин

33,3 нА

Ь = 100 раз;

1 2 5 2i100

А, ед/мл = - — - — — — = 0,624, 1000

При введении в ячейку 20 мкл получают: k = 1,2; а = 10 5 нА/мин; Ь =

= 50 раз

1 2 ° 10550

А ед/мл = - — -- — — = 0 63.

У

Аналогично рассчитаны и другие активности. Данные приведены в табл. 3.

Из табл. 3 видно, что наблюдается строгая прямолинейность увеличения тока (д?) от активности холестеролэстеразы в ячейке. Вычисленные удельные активности препарата из любой точки близки (среднее 0,308 Е/мг белка). Вычисленная удельная активность из построенного калибровочного графика (скорость реакции — количество холестеролэстеразы) составляет

0,305 Е/мг, т.е. практически совпадает., Предлагаемый способ является простым и экспрессным, так как отпадает необходимость приготовления радиоактивного субстрата или прозрачных образцов, применения пероксидазы и одианизидина. Метод основан на использовании простого оборудования и обеспечивает воэможность автоматизации процесса. По сравнению с электрофотометрическим методом используется B

10 раз меньше исследуемого образца, а время одного анализа в 6 раз короче: Процесс определения можно проводить непрерывно, например при ходе выделения или очистки фермента., Таким образом, упрощение способа заключается в сокращении времени определения до 4 мин, в возможности авм томатизации процесса, в использовании более простого оборудования, в исключении дополнительного применения пероксидазы и о-дианизидина.

1395677

Формула изобретения

Способ определения активности хопестеролэстеразы, предусматривающий приготовление реакционной смеси, содержащей фосфатный буфер, раствор фермента и субстрат, инкубацию ее и последующую оценку результатов, о тл и ч а ю щ и и с.я тем, что, с цеI лью упрощения способа, реакционную смесь помещают в электрохимическую ячейку и подвергают ее электролизу в присутствии платинового электрода, покрытого трехслойной защитной мембраной, а холестеролэстеразную активность оценивают по увеличению анодного тока

Т а б л и ц а 1.

Холе стеролоксидаз а, ед/мл

0,033 0,066 0,130 0,200 0,260 0,330 0,500

120 230 275 290 300 30I,Ток электрода, нА

Та блица 2, Концентрация холе:стерололеата, мМ

Увеличение тока электрода, нА/мин

2 41 2 80 2,81 2 80

О 96 1 41 2 О

Таблица 3

Количество хо- 6Т лестеролэстеразы нА/мин

Рассчитанная скорость ферментативной реакции в ячейке, мкмоль/мин мл

Рассчитанная удельная активность препарата, А мкг мкл ед/мл Е /мг

6,24 10

20

0,624

5,2

10,5 12 6 10 0,630

26,0 31 2 10 О, 624

41, 1 49, 3 10 0,617

50,4 60,5 10 0,605

62 7 75 2 10 О 602 О 301

250

125

Составитель Л.Борисова

Редактор Т.Лазоренко Техред Л.Сердюкова Корректор О.Кравцова

Заказ 2468/27 Тираж 520 Под пис но е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

20 40

50 100

80 160

100 200

О, 312

О, 315

0i312

О, 309

О, 303