Способ получения 3 @ -цианоморфолинопроизводного доксорубицина

 

Изобретение касается производных доксорубицина, в частности 3 -цианоморфолинодоксорубицина, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине . Цель - создание нового более активного соединения указанного класса . Его синтез ведут из хлоргидрата доксорубицина (ХР),который обрабатывают в водно-полярной органической среде 18 моль-экв 2,2-оксидиацетальдегида. Последующее непосредственное расщепление 1,4-ангидроэритритола в водном растворе ведут периодатом натрия при комнатной температуре в присутствии 2 моль-зкв по отношению к исходному ХР цианборгидрида щелочного металла (калия или натрия). Полу ченный сырой продукт разделяют на основные и нейтральные фракции. Последние хроматографируют на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси СН 01 -

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н flATEHTY

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHpblTHA (21) 3624053/23-04 (22) 18.07.83 (46) 07.06.88. Бюл. № 21 (71) Сри Интернэшнл (US) (72) Кэрол Волкер Мошер, Джордж Лоу

Тонг и Эдвард Ик Интош Эктон (US) (53) 547.455.07(088.8) (56) Патент США № 4301277, кл. 536-17А, опублик. 1981.

Патент США ¹ 4314054, кл. 536-17А, опублик. 1982. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 3 -ЦИАНОИОРФО-"

ЛИНОПРОИЗВОДНОГО ДОКСОРУБИЦИНА (57) Изобретение касается производ)1 ных доксорубицина, в частности 3 -цианоморфолинодоксорубицина, обладающего противоопухолевой активностью, что может быть использовано в медицине. Цель - создание нового более активного соединения указанного класса. Его синтез ведут из хлоргидрата (19) (111 (5B 4 С 07 Н 15 24 А 61 К 31/70 доксорубицина (ХР),который обрабатывают в водно-полярной органической среде 18 моль-экв 2,2-оксидиацетальдегида. Последующее непосредственное расщепление 1,4-ангидроэритритола в водном растворе ведут периодатом натрия при комнатной температуре в присутствии 2 моль-экв по отношению к исходному ХР цианборгидрида щелочного металла (калия или натрия). Полученный сырой продукт разделяют на основные и нейтральные фракции. Последние хроматографируют на колонке с силикагелем с использованием в качестве элюента смеси СН С1

2 2

СН>ОН (99:1).с постепенным увеличением количества СН ОН (9:1) в конце элюирования. Активная доза против лейкемии P -388 О, 075 мг/кг,лейкемии

L-1 210 О, 003 мкм (ДНК) и О, 0005 мкм (РНК) . 2 табл.

1402257

Изобретение касается способа полу7) чения нового 3 -цианоморфолинопроизводного доксорубицина формулы

О ОН

О ОН

15 (".1

20 обладающего противоопухолевой активностью.

Цель изобретения — получение нового производного доксорубицина, обладающего большей активностью, чем из- 25 вестный структурный аналог — доксорубицин и его аналоги.

Пример 1. Получение и отделение 3 -деамино-3 †(3 -циано-4 -мор(/ // н фолинил)доксорубицина и 3 -деаминон И 30

3 -(3 -циано-4 -морфолинил)-13-дигидродоксорубицина.

К перемешиваемому раствору, состоящему из 6,25 r (60,0 ммоль) 1,4ангидро-эритритола, характеризуемого формулой

ОН ОН

40 в 75 мл воды, охлажденной в водяной бане до 15-20 С, добавляют б,42 г (30 ммоль) метапериодата натрия. Полученный в результате чистый раствор перемешивают при комнатной температуре в течение 17 ч, величину рН раствора доводят от 3 до 7,3 с помощью

NaHCO> и затем полученный раствор разбавляют при перемешивании 75 мл

СН СН, при этом происходит образование осадка. Полученную смесь подвер50 гают перемешиванию и добавляют 0,126 г (2 ммоль) ИаВН СИ в 15 мл смеси, состоящей из СНэСМ и воды в соотношении, равном 1:1 (объемным). К этой смеси далее добавляют 1,16 г (2,0 ммоль) гидрохлорида доксорубицина в 30 мл смеси, состоящей из

CH CN и воды в соотношении 1:1. Спустя 10 мин полученную реакционную смесь разбавляют 50 мл разбавленного раствора NaHCO> и экстрагируют далее три раза с помощью СНС1 порциями по

Ъ

50 мл. Этот полупродукт — экстракт, I / t/ содержащий 3 -деамино-3 -(4 -морфолинил)доксорубицин,3 -деамино-3-(4 морфолинил)-13-дигидродоксорубицин ! (/ //

3 -деамино-3 — (3 -циано-4" -морфолинил) доксорубицин и 3 -деамино-3 — (3

t / It

// циано-4 -мо рфолинил) — 1 3- диг идр одок сорубицин. Соединенные экстракты подвергают экстрагированию с помощью

О,! н. уксусной кислоты 5 раз по

25 мл, а затем с помощью воды и далее промывают разбавленным раствором

NazHCO> и насыщенным водным раствором хлорида натрия, Кислотную водную фазу затем отделяют. Хлороформную фазу подвергают сушке с помощью сульфата натрия, фильтруют через целит-диатомовую землю и подвергают концентрированию с получением в, результате остатка. Этот остаток подвергают растворению в 25 мл CHCl u.

7 растворитель подвергают повторному выпариванию под вакуумом при комнатной температуре. В результате получают 0,518 г (407 от теоретического выхода) стеклообразного вспененного материала темно-красного цвета.

Образец этого вспененного стеклообразного материала в количестве

0,424 r подвергают растворению в

1,5 мл СН Cl и вводят в колонку размером .1,5 3,5 см, промытую СН Cl и заполненную селикагелем типа BiO-S il А имеющим размер частиц, соответствующий ситу № 200-400 (т.е. 0,074

0Ä037 мм). Колонку подвергают элюированию с помощью 50 мл СН Сl, а затем смесью, состоящей из СЙ Cl u

z 2

СН ОН, причем первая порция. объемом150 мл представляет собой смесь в соотношении 99:1. Вторая порция объемом 150 мл представляет собой смесь в соотношении 98:2, третья порция объ емом 300 мл представляет собой смесь в соотношении 97:3, четвертай порция объемом 100 мл представляет собой смесь в соотношении 95:5 и пятая порция объемом 300 мл представляет собой смесь в соотношении 90:10. После сбора начального элюата в количестве

445 мл фракцию объемом 80 мл подвергают выпариванию с получением в результате 0,217 r продукта. Этот ма3 14022 териал подвергают смешению с 0,039 г ,очищенного продукта, полученного ранее, и полученную смесь подвергают растворению в 2 мл СН Cl, разбавляют

10 мл СН ОН и выпаривают досуха. В результате растирания этого остатка

I с 5 мл CH OH получают 0,218 r 3 -де((I( амино-3 — (3 -циано-4 -морфолинил) доксорубицина. 10

Анализ данных, полученных с помощью жидкостного хроматографирования с высокой разрешающей способностью и методом ядерно-магнитного резонанса при частоте 400 МГц, показал, что этот продукт представляет собой диастереоизомерную смесь.

Анализ методом жидкостного хроматографирования с высокой разрешающей способностью на колонке типа С-18 фирмы "Maters Radial — Rak" с использованием 0,05 М буферного раствора цитрата, характеризуемого рН 4 и

СН С, в соотношении 65:35 при скорос- 25 ти подачи, равной 2 мп/мин, показал наличие двух близкорасположенных пиков, на 14,4 мин и 15,7 мин, в соотношении 58:39. Анализ спектра ЯМР этого материала при частоте, равной,. 30

400 МГц, показал существование двух ( резонансов для 1-Н, 2-Н, З-Н, 1 -Н, 7-Н, 14-Н, 9-0Н, ОСН., 10А-Н и !

6 -Н -протонов.

Данные анализа спектра ЯМР при частоте 400 ИГц, (CDCl>)((: 14,02 (синглет, 6-ОН), 13,26 (синглет, 11-0H), 8,05, 8,04 (2 дублета, 1-Н), 7,80, 7,79 (2 триплета, 2-Н), 7,41, 7,40 (2 дублета, 3-H) » 61, 5,57 (2 дуб- 40 лета, 1 -Н), 5,34, 5 30 (2 мультиплета, 7-Н), 4,79, 4,78 (2 синглета.

)4-Н ), 4,54, 4,42 (2 синглета,.9-ОН), 4,11, 4,10 (2 -синглета, ОСН ), 4,05 (мультиплет, 5 -H), 3,97 (мультиппет, 4В

2 " -В-Н, 3 -Н, 6 В-Н), 3,71. (мультиплет, 4 -Н, 6 -А-Н), 3,58 (триплет, 2 А-Н), 3,30 (дублет, J 19 Гц, 10 В-Н), 3,07, 3,06 (2 дублета,10А-H)

3,03 (мультиплет, 3 -Н), 2,69 (мультиплет, 5 " -Н„), 2,38 (мультиплет

8В-Н), 2,22 (мультиплет, 8А-Н), 1,84 (мультиплет, 2 -Н ), 1,61 (синглет, Н О), 1,40, 1,39 (2 дублета, Л6,5 Гц, 6 -Н,) .

Данные ультрафиолетового спектра

Vis (СНэОН) максимум 234 нм (Е 40, 100), 252 (27,700), 289 (9,420), 57

478 (13 000) 495 (13 000) 495 (12, 900), 530 (7, 190) .

Масс-спектр (как производные триметилсилила) м/е 899 M (триметилси), -НСЫ.

Вычислено,X: С 56,97; Н 5,68„

N 4,16.

Найдено,X: С 57,07 Н 5,37;

N 4,17.

Дальнейшее элюирование содержимо.го указанной колонки привело к полу((l чению 0,041 г 3 -деамино-3 -(3 -циано-4" -морфолинил)-13-дигидродоксорубицина.

Данные ультрафиолетового спектра

Vis (СНэОН) максимум 234 нм (t 37,400)

252 (28,000), 289 (9, 390), 475 (1 2, 700), 496 (1 2, 800 ), 530 (7, 410) .

Масс-спектр (как производные триметилсилила) и/е 985 М (триметилсилил) -СН, 973 М (триметилсилил) -HCN.

Вычислено,X: С 57,57; Н 5,89;

N 4,20 °

СЭ НэбйаО, 1,5 Н О

Найдено, Х: С 57, 35; H 5, 94; N 3, 82.

Предлагаемое соединение обладает . полезностью в качестве противоопухолевого агента для млекопитающих. Данная активность подтверждается данными исследований ин виво и ин витро.

В ОДНОМ из ОпытОВ ин ВиВО прОвОди мом в соответствии с протоколом, описанным в работе Camer Chemotherapy

Reports National Gamer Institute, 3, 11(2, ч.3, от сентября 1972 г., здоровые мыши инокулировались интраперитонально асцитной жидкостью лимфоцит лейкемия Р-388. Инокулированные мыши затем обрабатывались на 5,9 и 13 сут истекшего периода времени различными количествами предлагаемого соединения. Для сравнения другие мыши были необработанными, а еще дополнительная группа мышей обрабатывалась дауно. рубицином или доксорубицином, 3 -дез- амино-3 -(4, -морфолинил) даунорубицином или 3 -дезамино-3 -(4" -морфолинил)-13-дигидродаунорубицином, или

3 -дезамино-3 -(4-метокси-1-пиперидинил)даунорубицином или его 13-дигидро эквивалентом.

Среднее время выживания различных обработанных мышей определялось и сравнивалось со временем для мышей, инокулированных лейкемийной асцитной жидкостью, но которым не давалось

1402257

ОН

МЯСО О OH рО

Таблица

Активность против лейкемии P-388 на

Лейкемия L-1210 клетки

Соединение мышах

Оптимальная доза (040,5,9, 13), мг/кг

Ингибирование синтеза

Время выживания, 7. Т/C мкм

РНК

ЕД п, ДН1(I I

3 -Дезамино-3—

II и (3 -циано-4 морфолинил)-доксорубицин

357704

187.

0,075

О, 003

0,0005 никакого лечения испытываемым соединением, Данные, полученные таким образом, представлены в табл.! в виде величин

Т/С, которые представляют собой время выживания, обработанных мьппей, деленное на время выживания контрольных и умноженное íà 100. В таблице 1 даются также уровни дозировок различных соединений, которые наблюдаются для получения наилучших результатов улучшения времени выживания.

Результаты показывают, что предлагаемое соединение обладает противоопухолевой активностью ин виво от ! хорошей до превосходной при низких оптимальных дозировках. Соединение !

NSC 357704 показало уровень оптимальной дозы около 1/150 от дозы, требуемой в случае родительского соединения (т.е. от которого оно произошло) .

Дополнительные испытания были про-! ведены для подтверждения биологичес кой активности предлагаемого соеди нения, Это были испытания ин виво на мьппах против лейкемии P-388 и L-1210 и Меланомы В-16 которые осуществлялись по методике работы Cancer Chemotherapy Reports, 1972. Испытывались различные дозы и 1.P (интраперито нальный), 1.V (внутривенный) и оральный способы приема препаратов.

Противоопухолевая активность на мышах при оптимальной дозе (Е Р/с, ! мг/кг) представлена в табл. 2.

1 Новое соединение является среднетоксичным, Формула изобретения

Способ получения 3 -цианоморфолинопроизводного доксорубицина, формулы

О ОН

СΠ— СН ОН о т л и ч а ю щ и Р с я тем, что

20 хлоргидрат доксорубицина подвергают взаимодействию в смешанной водно-полярной органической среде с 18 мольэквивалентами 2,2-оксидиацетальдегида, полученного хп situ расщеплением

1,4-ангидроэритритола в водном растворе с периодатом натрия при комнатной температуре, в присутствии

2 моль-эквивалентов по отношению к исходному доксорубицину цианборгидЗО рида щелочного металла, например цианборгидрида натрия или калия, сы-, рой продукт реакции разделяют на основные и нейтральные фракции и последние хроматографируют на колонке с силикагелем, используя в качестве элюента смесь с объемным соотношением СН С1 /СНзОН 99:1, СНзОН/СН С1. с постепенным увеличением количества

СНзОН, до объемного соотношения 9:1

40 в конце элюирования.

1402257

Продолжение табл.!

Лейкемия L-1210 клетки тивность против кемин P-388 на

NSC

Соединение мыпая

Ингибированне синтеза мя вы ания, Т/С

EG у

ДНК мкм

РНК

360291

150

0,2

0,021

0,0030

Для сравнения:

130

Даунорубицин

Доксорубицин

82151

0,66

0,33

123127

160

0 58

1,5! I

3 -Дезамино-.3— (4" -морфолинил) даунорубицин а2475!

166

0,2

0,76

0,10

327450

132

0,2

2,2

0,67

Регистрационный номер Национального института рака Национального центра услуг США. таблице 2

Соедине арЬ1210

dIs ip

168 (5) !!5,9, iy

q 1-9,iy!

73(!) 262(0,0!25)

152(0,05) 252(7,5) 155(0,25) 185(! О) 257 (4) 152(0,5) I I

3 -Дезамино-3— (3 -циано-4 ((Il морфолинил)-13дигидродоксорубицин (3 -Дезамино-3— (4 -морфолинил)13"дигидродаунорубицин

ip P-388

dl, iy а1, а

44

1,5,9, ар птимэльая доза

040,5,9, 3) мг/кг

164(0,025)

»64(O,01251

166(0,0063) 1

I402257

Продолжение табл.2 вунору- Цоксоруицин бицин

SC 82151 NSC 123!27

NSC 327451 NSC 327450 NSC 357704

Соединение

>158(0,1) 285 (2) ъ197(20) >138(0,0063) 129,146(3) 123(0 0125) 195(4) 292(4) 135(0, 25) 12ll(0,25) П р и м е ч ° н и е. lp - Введение внутрибрваиино; Ь - внутрнвенио1 ро - через рот.

4 - день| q - греФин приеме, ненример q - кендой чет

44 эертый день.

Составитель Г.Коннова

Редактор С,Пекарь Техред А.Кравчук Корректор Л.Патай

Заказ 2796/58

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 à

1,5,9, ро

1-9, lp

ip В-1Ы.

dl, Ср

5,9,- 13, ip зр В )6

Н, Ср

Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, R-35,, Раушская наб., д. 4/5