Способ получения вещества, стимулирующего пролиферативный процесс эндокринного отдела поджелудочной железы

 

СО}О3 СООЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСИИХ

РЕСПУБЛИК (}Е 0}} (51)5 А 61 К 35/39

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H A ВТОРСЙОМЪ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДФРСТНЕКНЬЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТ}О (46) 07. 09. 90. Бюл. Ф 33 (21). 4151835/28 14 (22) 03.12,86 (7t) 1-й Московский медицинский институт им. И.М. Сеченова (72) Э.И. Гальперин, О.Ю. Абакумова и Я.Я. Ионочкина (53) 612.015 (088. 8) (56) Вабикова P.À. ° Виюмкин В.Я., Шальнев В.И., Полонская Л.В. Клеточные культуры иэ подкелудочной аелеэы плодов крупного рогатого скота, полученные с применением коллалитнна.

Вюа. экспер. биологии и медицины, 1977э т.83э I Зв с.350-. 353. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕЯК% ВЕЩЕСТВА СТЯ

МУЛИРУКЩЕГО ПРОЛИФЕРАТИВЯЩ BP0l@CQ

Э}ЩОКРИНЯОГО ОТДЕЛА ПОДЖЕЛУДОЧЯОИ

ЖЕЛЕЗЫ (57) Иэобретение относится к эндокри нологии. Поднелудочные аелеэы крыс иэмельчают, диспергирувт в. О,ЗХ-ном растворе коллалитина и ресуспендиру вт в среде 199. Осадок гояогениэирувт. Гомогенат центрифугируют, надосадочную аидкость црогревавт, центрифугирувт и фильтруют. Полученное вещество обеспечивает более раннюв и полноценнув компенсацию инсуляр-. ной недостаточности.

1412061

10 ной железе после ее обширных резекций.

".-::жлцами, после чего продавливают через сетку с диаметром пор 1-2 мм. 40

Фрагменты ПЖ диспергируют в О,ЗХ-ном иасуворе Коллалитина (активность—

147,-2 ше.,приготовленного на раство- ре Нап1в (80 мл).в течение 20 мин в магнитной мешалке при 20-22 С. После 45 отстаивания фрагментов ПЖ надосадочную жидкость сливают. Осадок трижды ресуспендируют в среде 11 199 (70 мп) с последующим отстаиванием и удалением надосадочной жидкости. Из полученной смеси ОЛ (70 мп) получают вещество для коррекции инсулярной недостаточности. Взвесь ОЛ (70 мп) гомогенизируют в гомогенизаторе тефлон-стекло (в модификации Поттера) при 4 С в трех объемах дистиллированной воды (240 мп) в течение 1 мин.

Гомогенат (320 мп) центрифугируют на центрифуге F -70 при я3000 об/мин

Изобретейие относится к медицине, а именно к эндокринологии, Цель достигается путем использования регенерирующей поджелудочной железы взрослого донора, из которой вьщеляют островки Лангерганса, а из них после соответствующей обработки получают средство, содержащее факторы, стимулирующие пролиферацию (ФСП) островков Лангерганса в поджелудочСпособ осуществляют следующим образом.

Для получения средства используют регенерирующую,поджелудочную железу (ПЖ) крыс-доноров. Для этого у 170 беспородных белых крыс-самцов массой

200-220 r под эфирным наркозом после среднесрединной лапаротомии производят резекцию селезеночного отдела поджелудочной .железы (что по массе составляет 50X) и спленэктомию (так как поджелудочная железа в этом отделе имеет интимную связь с сосудами селезенки). Срединную рану ушивают наглухо.

Через 36-44 ч доноров забивают методом декапитации и сразу же забирают поджелудочную железу, которую помещают в чашку Петри (манипуляции гроводят при 0 С). Масса полученной

Ы от всех доноров 80 г.

Островки Лангерганса выделяют из .полученной ткани, т.е. из регенерирующей ПЖ по следующей методике.

Поп;.-.елудочную железу (масса 80 г) :.>двергают мехачическому измельчению

35 и 44С в течение 20 мин, Надосалочную жидкость (290 мп) прогревают прн температуре 100 С в течение 15 мин, Повторно центрифугируют при тех же условиях и фильтруют через миллипоровый фильтр "АпКз" 0,3-0,6 мк ("Сынпор", ЧССР).

Полученное вещество в количестве

280 мл содержит до 0,5 мг/мп белка (определенного по .методике Лоури) и приводит к стимуляции синтеза ДНК .в ткани ПЖ крыс с инкреторной недостаточностью в 1,9; 3,2 и 2,6 раэ

:соответственно через 10,12 и 24 ч после- введения.

Определение активности вещества, Активность полученного вещества определяют на 30 беспородных белых крыса-самцах массой 160-180 r у которых ИН вызывают по следующей схеме: производят резекцию 50Х ткани.

ПЖ (по вышеописанной, методике), через

24 ч и 48 ч им внутрибрюшинно, вводят

57.-ный водный раствор Аллоксана (фирмы "Chemapol", ЧССР). Через 48 ч после последней инъекции Аллоксана у крыс развивается инкреторная недостаточность, проявляющаяся клиникой сахарного диабета (глюкоза крови—

276,6+18,9 мгЖ). В эти сроки 15 кры- . сам с ИН внутрибрюшинно в дозе 1 мп вводят полученное средство, содержащее ФСП (опыт), 15 крысам в той же дозе вводят внутрибрюшинно физиологический раствор (контроль).

Активность вещества оценивают по степени его влияния на синтез ДНК в ткани ПЖ у крыс опытной и контрольной групп. Синтез ДНК в ткани ПЖ определяют через 10,12,20 и 24 ч после введения средства и фиэиологичес" кого раствора.

Синтез ДНК (удельную активность

ДНК) определяют после внутрибрюшинного введения Н -тимидина (СССР) по э

100 мкКи на крысу. Время экспозиции

90 мин. Животных забивают методом декапитации, после чего сразу забирают ткань ПЖ и помещают ее в лед. Ткань гомогенизируют в гомогенизаторе тефлон-стекло (в модификации. Поттера) при 4 С в 3 объемах 0,05 М трис-НС1-, буфера, рН-7,7, содержащего 0,25 М сахарозу 0,005 М М8С1» и 0,025 М КС1

В аликвотах гомогената определяют (в О, 1 мп) удельную радиоактивность и содержание ДНК. Удельную радиоактивность определяют после осаждения ченных ОЛ отпадает

3 1412 кислоторастворимого материала 107.— ной ТХУ и нанесения его на миллипоровые фильтры (У 2 Synpor, ЧССР) в жидкостном сцинтйлляционном счетчике

Merk II (Nuc1ear Chicago, США) в сцинтнлляторе ЖС-106 (СССР}. Содержание ДНК определяют по методу Блобеля и Поттера. Результаты выражают в импульсах в 1 мин. 10

В результате получают данные, что введение вещества приводит к стимуляции синтеза ЛНК в ткани ПЖ крыс с экспериментальной инкреторной недос»таточностью через 10, 12 и 24 .ч соответственно в 1,9; 3,2 и 2,6 раз (по сравнению с контрольной группой).

В опыт взято 18 беспородных собак обоего пола, массой от 5 до 18 кг.

Всем произведена субтотальная (857) резекция поджелудочной железы с перевязкой панкреатического протока. Жинотные разделены на две группы, в первой (10 собак), введения средства не производили (контроль), во второй (8 собак). Животным внутрибрюшинно .сразу же после операции вводят йолученное средство иэ расчета 4,0-5,0 мл на 1 кг массы тела (опыт), средство

i имеет следующую характеристику: содержание белка — не более 0,5 мг/мп, активность — усиление синтеза ДНК в ткани ПЖ крыс с ИН в 1,9; 3,2 и 2,б раз соответственно через 10,12 и 24 ч.

В послеоперационном периоде у жи- вотных первой группы уровень глюкозы

35 в крови натощак остается высоким в течение 3 нед после операции, а толерантйость к глюкозе — сниженной на протяжении всего периода наблюдения 4 (1 мес.). Эта обусловлено снижением секреции инсулина, о чем свидетельст- . вовало уменьшение содержания инсулина и С-пептидов в крови натощак и в процессе проведения -сахарной нагрузки.

Кроме того отмечается временное (в течение 2 нед.) повышение уровня контрисулярного гармона — глюкагона.

Для »гистологической картины ПЖ

I в различные сроки после операции у животных данной группы было характерно нарастание дистрофии, фиброэа и атрофии ацинусов и части островков

Лангерганса. Однако наряду с этим . в ПЖ спонтанно протекают репаративные процессы (гипертрофия ОЛ, увеличение количества переходных ациноостровко- . вых клеток), которые и определяют временный характер гипергликемии. Одкако эти процессы не обеспечпнают полноценной компенсации инсулярной недостаточности, о чем свидетельствует низкий уровень инсулина и С-пептнда, а также снижение толерантности к глюкозе на протяжении всего периода наблюдения.

Во второй группе (опыт) введение средства приводит к снижению содержа ния глюкозы в крови натощак уже со

2 сут. после операции и вплоть до конца наблюдения и к стабильной компенсации ИН (т.е. к нормогликемии) с нормализацией толерантности K глюкозе уже со 2 нед. после операции.

Это сопровождалось усилением синтеза инсулина (достоверным повышением содержания инсулина и С-пептида в крови натощак и в процессе проведения ca"".. харной нагрузки), а также менее значительным увеличением содержания глюкагона.

Введение препарата (средства) приводит к значительным морфологнческим изменениям в оставшейся части ПЖ, отмечается выраженная гипертрофия и увеличение количества ОЛ и ациноостровковых клеток (достоверно выше, чем в контроле) . В ОЛ обнаруживаются единичные фигуры митозов.

Таким образом, введение полученного средства собакам, перенесшим обширную резекцию ПЖ (85K), стимулирует спонтанно протекающие в ней репаративные процессы и приводит к более ранней и полноценной компенсации ИН, ° не вызывая при этом аллергических реакций.

Преимушеством предлагаемого способа получения средства для коррекции инсулярной недостаточности является следующее.

В качестве доноров можно йспользовать взрослых животных, что (технически) облегчает получение средства, необходимость культивирования полуМожно использовать ПЖ от нескольких доноров, так как предлагаемый способ обработки ксено-ПЖ предусматривает удаление из ткани Пф термолабильных белков и снижает возможность возникновения аллергических реакций . у реципиента,.

Средство приводя к стимуляции процессов репарации в оставшейся пос5 1412061 .6 ле S5X-ной резекции части ПЖ, обеспе- лези, включающий измельчеяие резерцичивает образование новых функциональ- рованных подкелудочных желез крыс,. но активных эндокринных элементов днспергировяние и O,ЭХ-ном растворе

ПЖ ""собственных" ОЛ, функционирование6 коллалитина нри 20-22 С, ресуспендикоторых обеспечивает компенсацию ИН рование -в среде 1 199, далее;, осадок и ннвелирование Клиники сахарного .. гомогенизнруют в дистиллированной диабета у экспериментальных животных. воде 1-2 мин при 4+О, 1 С, гомогенат центрифугируЬт при 3000 об/мин в теФ о р и у л а и s о б р е т е н и я 10 чение 20-30 мин, надосадочную жидкость прогревают при т.кип. воды в течение

Способ получения вещества, стиму- 15-20 мнн, повторно центрифугируют лирукнцего пролиферативный процесс в тех же условиях, фильтруют через. эидокрийного отдела полжелудочной ме- фильтр с диаметром. пор 0,3-0,6 мк, 1

Составитель Н. Литвиненко

Редактор Т. Шагова Техред И.Дидык Корректор Л. Патай

Заказ 3319 тираж 546 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Рауаская наб,, д. 4/5

Ю

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул, Проектная, 4