Способ переноса генов в растения, штамм бактерий agrobacterium tumefaciens для переноса генов в растения и рекомбинантная векторная плазмидная днк рак 320 neo для переноса генов в растения
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и представляет собой способ переноса и включения в геном высших растений отдельных генов. Целью изобретения является упрощение процесса переноса генов в растения с помощью плазмид агробактерий и создание способа, сочетающего преимущества векторной системы на основе Ri-плазмид и удобных для клонирования генов вектора наибольшего размера, получение векторной плазмиды и бактериального штамма, используемых для этих целей. Конструирование векторной мини-Ti-плазмиды на основе челночного бирепликонного вектора раК333, содержащего кроме репликона Ti-плазмиды область правого конца Т - ДНК Ti-плазмиды, обеспечивающего инициацию переноса сцепленных с ним генов в клетки растений, и сцепленный с правым концом Т - ДНК ген устойчивости к канамицину (неомицинфосфотрансферазы), находящийся под контролем промотора гена нопалинсинтетазы из плазмиды Ti C58, что обеспечивает его экспрессию в клетках растений (или другой ген, который хотят перенести в геном растения. Получен бактериальный штамм Agrobacterium tumefaciens C58CI, несущий Ri-плазмиду - помощник pRi 15824, обеспечивающий функции вирулентности в клетках агробактерий, необходимые для переноса Т - ДНК. Получена мини - Ti-плазмида, содержащая переносимый ген. Штамм получают путем переноса векторной плазмиды при конъюгации из E. coli в штамм A. tumefaciens C58CI (pRi, 15824). Инфекцию полученным штаммом сегментов листьев табака и получение фитогормоннезависимого роста трансформированных растительных клеток в виде пролиферирующих корней осуществляют на соответствующей питательной среде, а регенерацию побегов целого растения из трансформированных клеток корней - на селективной среде, содержащей канамицин. 3 с. п. ф-лы.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии высших растений, и представляет собой способ переноса и включения в геном высших растений отдельных генов. Целью изобретения является упрощение процесса переноса генов в растения с помощью плазмид агробактерий, Создан способ, сочетающий преимущества векторной системы на основе Ri-плазмид и удобного для клонирования генов вектора небольшого размера, получение векторной плазмиды и бактериального штамма, используемых для этой цели. В уникальный Hind III-сайт бирепликонного челночного вектора рАК333, автономно реплицирующего в клетках Е. coli и Agrobacterium, клонируют Hind III-фрагмент размером 4,0 т. п. н из плазмиды pLGV 23 Neo, содержащий бактериальный ген устойчивости к канамицину под контролем нопалинсинтетазного промотора, обеспечивающего экспрессию в клетках растений, и связанный с ним сегмент Т-ДНК из нопалиновой Т-плазмиды рТi С58, обеспечивающий при условии функционирования продуктов генов вирулентности перенос и включение в геном растительных клеток, затем полученную плазмиду рАК 320 Neo с помощью конъюгации переносят в штамм А. tumefaciens С58Cl (рRi 15834), после чего полученным штаммом А. tumefaciens C58Cl (рАК 320 Neo, pRi 15834), несущим неонкогенную векторную мини-Ti-плазмиду и плазмиду-помощник дикого типа pRi 15834, обеспечивающую комплементацию функций вирулентности in trans, осуществляют инфекцию сегментов листьев табака, в результате чего получают рост трансформированных растительных клеток на селективной питательной среде, содержащей 50 мнг/мл канамицина, характеризующийся фитогормоннезависимой пролиферацией корней, после чего на среде, содержащей цитокинин 5-бензиламинопурин (БАП) в концентрации 1 мкг/мл, получают образование побегов, устойчивых к канамицину, и регенерируют целые растения, включающие ген устойчивости к канамицину. П р и м е р 1. Конструирование векторной мини-Ti-плазмиды рАК 320 Neo. С помощью обработки рекстриктазой Hind III и ДНК-лигазой Т4 и последующей трансформации штамма Е. coli К802 в уникальном Hind III-сайте бирепликонной челночной векторной плазмиды рАК 333 клонируют Hind III-фрагмент размером около 4,0 т. п. н из плазмиды pLGV 23 Neo, который содержит следующие расположенные друг за другом элементы; область правого конца Т-ДНК из наполиновой плазмиды pTi С58, промотор гена нопалинистазы, обеспечивающий экспрессию в клетках растений и слабую экспрессию в клетках бактерий (что обеспечивает селекцию при клонировании гена устойчивости к канамицину под контролем указанного промотора в бактериях), структурный ген АРН П под контролем нопалинсинтазного промотора и сигнал полиаденилирования мРНК из нопалинсинтазного гена. В результате получен штамм E. coli K12 K802 (pAK 320 Neo). Описание штамма. Штамм А. tumefaciens C58Cl (pAK 320 Neo, pRi 15834) по способу культивирования и морфологии не отличается от любых штаммов А. tumefaciens, в том числе - штамма А. tumefaciens C58Cl (pRi 15834). Предлагаемый штамм может индуцировать у двудольных растений при инфекции заболевание "бородатый корень", для которого характерна полиферация корней, причиной которого на молекулярном уровне является перенос и включение в растительный геном Т-ДНК. Предлагаемый штамм содержит векторную плазмиду рАК 320 Neo, что обеспечивает перенос в растения также гена устойчивости к канамицину. П р и м е р 2. Конъюгационный перенос плазмиды рАК 320 Nео из Е. coli в А. tumefaciens C58Cl (pRi 15834). Суспензию клеток Е. соli K 801 (pAK 320 Neo) 5х108 клеток смешивают с 5х108 клеток штамма-помощника НВ101 (pRK 2013) и с 5х108 клеток реципиента А. tumefaciens C58Cl (pRi 15834), осаждают смесь бактерий на фильтрах с диаметром пор 0,45 мкм и инкубируют на агаризованной питательной L-среде 18 ч, при 30оС для проведения скрещивания, затем смесь высеивают на селективную среду. В соответствии с маркерами донорной плазмиды рАК 320 Neo - устойчивость к ампициллину (или карбенициллину), АрR и хлорамфениколу, CmR и реципиентного штамма А. tumefaciens C58Cl - устойчивость к рифампицину, rifR, селекцию эксконъюгантов проводят на среде, содержащей 100 мкг/мл карбенициллина, 25 мкг/мл хлорамфеникола и 50 мкг/мл рифампицина. В результате получен штамм А. tumefaciens C58Cl (pAK 320 Neo, pRi 15834). Способ переноса гена устойчивости к канамицину в геном табака поясняется следующими примерами. П р и м е р 3. Инфекция дисков листьев табака Nicotiana tabacum штаммом А. tumefaciens C58Cl (pAK 320 Neo, pRi 15834). Подращиванием в жидкой L-среде получают суспензию клеток А. tumefaciens C58Cl (pAK 320 Neo, pRi 15834), содержащую 5х108 клеток/мл. Из листьев стерильных растений табака N. tabacum сорт Самсун вырезают сегменты или диски размером 3-5 мм, которые смешивают с суспензией инфицирующих бактерий и инкубируют при 20оС в темноте в жидкой среде MS, содержащей фитогормоны НУК - 0,1 мкг/мл и БАП - 0,5 - 1,0 мкг/мл. Затем диски листьев отмывают от агробактерий и помещают на агаризованую MS среду без фитогормонов для формирования трансформированных корней, в которую также добавляют 500 мкг/мл антибиотика клафорина (натриева соль цефалоксина) для убивания агробактерий. Через 2-3 недели инкубации при 25оС образовываются полиферирующие корни, после чего диски с корнями переносят на MS-среду, содержащую 1,0 мкг/мл БАП, где происходит формирование побегов, устойчивых к 50 мкг/мл канамицина. Из устойчивых к канамицину побегов регенерируют целые растения на среде МS без добавления гормонов. П р и м е р 4. Проверка стабильности наследования признака устойчивости к канамицину трансформированными растениями. Из листа одного из трансформированных растений табака вырезают диски, которые помещают на агаризованную MS-среду, содержащую 0,1 мкг/мл НУК и 1,0 мкг/мл БАП и 50 мкг/мл канамицина. В качестве контроля на ту же среду помещают диски листьев нетрансформированного растения табака. Через 2-3 недели инкубации на свету при 25оС по краям дисков листа трансформированного Km-устойчивого растения происходит формирование побегов, которые отсутствуют или резко отстают в росте в контроле, что свидетельствует о стабильной трансформации полученного растения по признаку устойчивости к канамицину. П р и м е р 5. Анализ геномной ДНК трансформированных клеток растений с помощью гибридизации ДНК. Из ткани трансформированных растений выделяли тотальную ДНК, которую фрагментируют с помощью обработки рестриктазой, фракционируют путем электрофореза в агарозном геле, переносят на нитроцеллюлозный фильтр и проводят гибридизацию с радиоактивной меченой пробой - ДНК плазмиды, содержащей ген АРН П, согласно известному методу Саузерна. Результаты гибридизации подтверждают присутствие в геноме трансформированного растения последовательности ДНК, гомологичной бактериальному гену устойчивости к канамицину АРН П. П р и м е р 6. Определение активности неомицинфосфотрансферазы в трансформированных клетках табака. Активность неомицинфосфотрансферазы в растительной ткани тестировали по методу, который позволяет количественно и качественно оценить активность АРН П в экстрактах клеток. Проведенный анализ показал, что в экстрактах клеток трансформированного растения присутствует активность АРН П, идентичная ферментативной активности в клетках бактерий, несущих исходную векторную плазмиду. В экстрактах клеток нетрансформированного растения аналогичная активность не обнаружена. П р и м е р 7. Клонирование гена экстенсина моркови в векторе рАК 320 Neo, обеспечивающем последующий перенос гена в растения. Фрагмент ДНК, содержащий полный ген экстенсина моркови, вырезают с помощью рестриктазы Е. coRI из содержащей этот ген плазмиды pDA5AI, препаративно элюируют из агарозного геля известными стандартными методами, затем смешивают с предварительно гидролизованной по Е. сoRI ДНК векторной плазмиды рАК 320 Neo (в которой сайт Е. coRI уникальный) и обрабатывают смесь ДНК-лигазой Т4. Лигированной смесью трансформируют штамм Е. сoli К802, отбирают клоны, несущие плазмиду, на среде с ампициллином (100 мкг/мл) и анализируют ДНК плазмид из отдельных клонов с помощью гидролиза рестриктазой Е. сoRI и электрофореза в агарозном геле. Сравнение с исходными векторными и родительской плазмидой позволяет отобрать вариант рекомбинантной плазмиды, содержащий ген экстенсина моркови, клонированный в векторе рАК 320 Neo и сцепленный, таким образом, с маркером устойчивости к канамицину, - плазмиду рАК 320 Neo-ехt. П р и м е р 8. Перенос в растения гена экстенсина моркови, сцепленного с маркером устойчивости к канамицину. Осуществляют перенос рекомбинантной векторной плазмиды рАК 320 Neo-ex в штамм А. tumefaciens C58Cl (pRi 15834), как описано в примере 2. Полученным штаммом А. tumefaciens C58Cl (pAK 320 Neo-ext, pRi 15834) инициируют листовые диски табака, как описано в примере 3, и отбирают трансформированные устойчивые к канамицину побеги на среде, содержащей 50 мкг/мл канамицин сульфата. Согласно известным данным, полученным для системы бинарных векторов аналогичного типа, перенос в геном растений гена устойчивости к канамицину, по которому проводится тестирование переноса, в системе бинарных векторных плазмид гарантирует также перенос в растение сцепленных с канамициновым маркером генов. (56) Molec. Gen. Genet. 1986, 202, p. 388-393.
Формула изобретения
1. Способ переноса генов в растения с помощью плазмид Agrobacterium, включающий инфицирование растений бактериями, несущими две плазмиды, одна из которых - мутантная неонкогенная Ti-плазмида A. tumefaciens, индуцирующая перенос в растительные клетки мутантной неонкогенной Ti - T - ДНК, не вызывающая опухолевой пролиферации клеток растений, а другая -Ri-плазмида дикого типа A. rhizogenes, вызывающая у чувствительных растений фотогормоннезависимую пролиферацию корней, состоящих только из генетически однородных трансформированных растительных клеток, включивших в геном Ri - T - ДНК, получение трансформированных генетически однородных клеток растений, включивших в геном одновременно Ri - T - ДНК и мутантную Ti - T - ДНК, регенерацию из трансформированных клеток побегов и целых растений, включивших в геном только мутантную Ti - T - ДНК, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса переноса гена, используют штамм A. tumefaciens ВКПМ В-3836, содержащий рекомбинантную векторную мини - Ti - плазмиду pАК 320 NeO, неспособную самостоятельно вызывать перенос генов в растения, и плазмидупомощник дикого типа pRi 15834, индуцирующую перенос в растительные клетки как собственной Ri - T - ДНК, так и Т - ДНК векторной плазмиды рАК 320 NeO. 2. Штамм бактерий Agrobacterium tumefaciens ВКПМ В-3836 для переноса генов в растения. 3. Рекомбинантная векторная плазмидная ДНК pАК 320 NeO для переноса генов в растения размером 13,0 т. п. н. , содержащая бирепликонную челночную векторную плазмиду pАК 333 размером 9,0 т. п. н. с репликоном нопалиновой Ti-плазмиды рTi С58 и репликоном мультикопийной плазмиды E. coli pBR 325 с геном устойчивости к ампициллину (карбенициллину) и хлорамфениколу; клонированный в Hind Ш-сайте фрагмент ДНК размером около 4,0 т. п. н. с областью правого конца Т - ДНК из плазмиды pTi C58, которая обеспечивает в присутствии активных генов вирулентности Ti- или Ri-плазмид перенос и включение в геном растений, сцепленных с указанной областью генов и со сцепленным с правым концом Т - ДНК промотором гена нопалинсинтетазы из плазмиды pTi C58, обеспечивающим экспрессию в клетках растений генов, находящихся под контролем указанного промотора; структурный ген неоницинфосфотрансферазы, определяющий устойчивость к канамицину, находящийся под контролем нопалинсинтетазного промотора; сигнал полиаденилирования мРНК из гена нопалинсинтетазы; уникальные сайты рестрикции для клонирования ДНК : Bam HI, SmaI, E. coRI; емкость вектора при клонировании фрагментов ДНК в клетках Escherichia coli - до 7 т. п. н. ; емкость вектора при репликации в клетках A. tumefaciens за счет автономного репликона Ti - плазмиды - до 200 т. п. н. спектр хозяев: E. coli и A. tumefaciens.MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 02.07.1996
Номер и год публикации бюллетеня: 36-2002
Извещение опубликовано: 27.12.2002
