Способ получения пептидов

 

Изобретение касается пептидов, в 1ас1 ности соединений общей ф-лы I R,-Ala-Asp Ala-Ile Phe-Thr-Rg-Ser- Tyr-Arg-R -R ,-Leu-Gly-Gln-R .-R |g - Ala-Arg-Lys-Leu-R2j-R24-R2S-Tle-Nle- R g-Arg-NHj, где R - N- Me-Tyr или His; Rg- Ser или Asn; Rf - Arg или Lys; R fi - He или Valj R,- - Leu или D-Leu-; R yg - Tyr или Ser; - Leu или D-Leu; R - His или Glu; R 25- - Glu или D-Glu или Asp; - A.sn или Ser, которые обладают способностью прокотировать вьщеление гормона роста, что может быть использовано в сельском хозяйстве; Цель изобретения - создание новых более активных и менее токсичных пептидов. Их синтез ведут из з ащищенного группой вое или ТОС аргинина, который связывают с метилбензгидриламиновой смолой (МБГАС) с последующим отщеплением группы БОС. Затем проводят последовательное наращивание пептидной цепи в указанной в ф-ле I последовательности с использованием 1-2 ммоль защищенной аминокислоты на 1 г смолы МБГАС. Процесс ведут в среде диметилформамида и/или метиленхлорида1 Получают пептидную смолу общей ф-лы II. ,(Х)или Xi-Ala-Asp(X -Ala-Ile- Phe-Thr(X4)-RJ(X4Или Xj)-Ser(X - Tyr (X,2)-Arg(X)-R ,(Х или X7)-Ri3-Leu-Gly- Gln(Xj)-R п-R (8 (Xj)-Ala-Arg(Xg)- Lys(Xp-Leu-R23-Ri4(X6 или X)- R(Xj)-Ile-Nle-R28 (X или Xj)-Arg- NH-Z, где R, -Rg, R (г-т;, , R fT-re указаны; или БОС; или 2,6-дих.порбензоил; X или OBZ1; или бензил; или ксантил; или тозил; Х-,Н или 2-хлорбензилоксикарбонил; или МВНА. В этой смоле отщепляют защитные группы и полимерную подложку обработкой или HF при (-20)-0 С в присутствии анизола и/или метиленсульфида,- Целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления . Новые пептиды в сравнении с ичвестным hpGRF(1-40)OH обеспечивают лучшую активность при более длитель-. ном времени действия (до 9,3 ч против 2,2 ч)и невысокую токсичность. 1 табл. g О) С 4k СП Ч см

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

5157 АЗ (1% (Ш

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ 13, Ий >-.:

И ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (2i) 3791983/23-04 (22) 12,09.84 (31) 532170; 545094 (32) 13.09.83; 25.10.83 (33) US

- (46) 30.10.88. Бюл. У 40 (71) Дзе Салк Институт фор Биолоджикал Стадиз (US) (72) Жан Эдвард Фредерик Ривье (CH) и Вили Уолкер Вейл, МЛ (US) (53) 547.964.4.07(088.8) (56) Химия полипептидов./Под ред.

Катсолниса. M.: Мир, 1977, гл. 16, с. 368.

Патент ClHA N- - 4292313, кл, С 07 С 103/52, опублик. 1982. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ (57) Изобретение касается пептидов, в частности соединений общей A-лы I

R,„-AAla-Asp-А1а-Ile-Phe-Thr-R -SerTyr Arg Rr< R,>-Leu Gly Gln R,4дRrg

Ala .Arg Lys Leu R2ç R 24 R <-Tle-NleR >-Arg-МН где К „— N Ме-Туг или

His» R> = Ser или Asn; КИ вЂ” Ага или Lys; R ц — Ile или val; R4 .—

Leu или D-Leu; R — Туг или Ser;

R<> — Leu или D-Leu; R 4 — His или

Glu; R < — Glu или Р-Glu или Asp;

К4 — Asn или Ser, которые обладают способностью промотировать выделение гормона роста, что может быть использовано в сельском хозяйстве. Цель изобретения — создание новых более активных и менее токсичных пептидов.

Их синтез ведут из защищенного груп(5,1)4 С 07 К 7 20 А 61 К 37/02 пой ВОС или ТОС аргинина, который связывают с метилбензгидриламиновой смолой (МБГАС) с последующим отщепле- . нием группы ВОС. Затем проводят последовательное наращивание пептидной цепи в указанной в ф-ле I последовательности с использованием 1-2 ммоль защищенной аминокислоты на 1 г смолы

МБГАС. Процесс ведут в среде диметилформамида и/или метиленхлорида Получают пептидную смолу общей ф-лы II.

X „-Р,(Х )"или Х -А1а-Аяр(Х s)-Ala-IlePhe — Тпг(Х4)-К (Х4или Х ))-Бег(Х ) Туг (Х2) -Arg (Х ) -R i (Õ < или Х ) -К -Leu-G1yG (X < ) -R „-Rr,< (Х ) -Ala-Arg (X r; )Lys (Х ) -Leu-R гэ К 4 (Хб или Х )—

R < (X ь) -I l e N le К в (Х4 или Х ) -ArgNH-Z, где Rr,э,К 8в R -я в R r> (8 э И

R. gg указаны; Х1=Н или ВОС; Х =Н или 2,6-дихлорбензоил; Х =Н или OBZ1;

Х4=Н или бензил; Х =Н или ксантил;

Х =Н или тозил; Х1=Н или 2-хлорбензилоксикарбонил; Z=BHA или MBHA. В этой уеееа смоле отщепляют защитные группы и по- ф лимерную подложку обработкой СР СООН или HF при (-20)-0 С в присутствии анизола и/или метиленсульфида.- Целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Новые пептиды в сравнении с известным hpGRF(1-40)ОН обеспечивают лучшую активность при более длитель-. ном времени действия (до 9,3 ч против 2,2 ч) и невысокую токсичность.,фо

1 табл.

)435!57

Время смешиВания9 мин О

1. 607 TFA/2% этандитиол 10

2. 60%-. TFA/27. этандитиол, 15

3. IPA/17. этандитиол 0,5

4. Е зN(1()%) в СНтС12 0,5

5. МеОН 0,5

6, Ft>N(107) в СН С! О 5

7. МеОН (дважды) 0,5

8, СН С1 < (дваждьr) О, 5

Присоединения предпочтительно про одят в соотве ствии с графиком опефаций В:

Реактив

Время смешивания, мин

9. DCC1

10. ВОС-аминокислота

50-90

Изобретение относится к способу

,получения пептидов - новых биологи. чески активных соединений, которые могут найти трименение в медицине.

Цель изобретения — синтез новых производных пептидов — малотоксичных, обладающих более высокой способностью промотировать выделение гормона роста.

Пример 1. Синтез пептида (D-Glu Г!1е J -rhGRF(1-29)-NH<, К-His-Аlа-Азр-Ala-Ile-Phe-Thr-SerSer-Tyr-Arg-I.1е-Leu — Gly-С1п-Leu-TyrAla-Arg-1.ys-Leu-Leu-His-DGlu-Е1е-Nle- 15

Asn-Arg-NH< проводят моностадийно на пептидном синтезаторе "Бекман 990" с использованием 2 r смолы МВНА, имеющей диапазон замещения О, 1

0,5 ммоль/г смолы, Присоединение ВОС- 2()

Atg(TOS) к смоле осуществляют используя KF в смеси 50% в метиленхлоо риде при 60 С в течение 24 ч при перемешивании, при этом происходит замещение 0,35 ммо ть Arg на 1 г 25 смолы.

После деблокирования и нейтрализации на смоле стадия за стадией строят пептидную цепь. Все используемые астворители тщательно дегазируют 30 барботированием инертного газа, наример гелия или азота, чтобы гаранировать отсутствие кислорода, котоьп мог бы привести к нежелательному кислению серы Met-остатка.

Деблокирование предпочтительно роводят в соответствии с графиком операций А:

Реактив

1! . Г1еОН (дважды) О, 5

12. СН С (двлжды) О, 5 !

3. АстО (3I1? в

СН,С1., 15,0

14 СНяC 1 0,5

15. МеОН 0,5

16. СН С1 (дважды) 0,5

В кратком изложении, 1-2 ммоль

BOC-защищенной аминокислоты в мет ленхлориде используют «а 1 г смоль, добавляют одив эквивалент 1,0 M

1)СС1 в метиленхлориде в течение 2 ч для большинства аминокислот, за исключением ВОС-Arg(TOS). Br1-эфир использован в качестве защищающей гидроксил боковой цепи группы для Ser и Thr. Амидогруппы Asn rr Gin защищены e Xall, когда используется

DCC-присоединение, что и предпочтено.

Р-нитрофенильный эфир (ОГ!Р) также может использоваться для ак-.ènàöèè карбоксильного конца Азп или Gln, например BOC-Asn-(ONP) может быть присоединен в течение ночи с использованием одного эквивалента НОБг. в 507. смеси ДМФА и метиленхлорида, в этом случае DCC не присоединяется. 2-Хлорбензилокснкарбонил вЂ(2С1-Z) использован в качестве защитной группы для боковой цепи LgS. TOS использован для защиты гуанидиногруппы Arg и имидазольного азота Нть, а карбоксильная гругпа боковой цепи С1п или Агр защищена с помощью ОВ21. Фенольная гидроксильная группа TYr защищет!а с помощью 2,6-дихлорбензила (DCB).

В конпе синтеза получают полимерную смолу следующего состава: ВОС/

N" МеНis (Х)-Alа-Asр(X з) -Лlа — Il е — PheThr(X <) — Бег(Х <) -Ser(X<) -Tyr(X )—

Arg (X

I,eu — Tyr(X ) — I l e-Me t-Ash (Х )

Arg (X <) -Х, где X-TÎS, Х2-DСВ,Х g — OBZ1, Х„-ВЕ1, Х<-Хап, Х6-TÎS,.X„-2С1-Z и Хч представляет собой — NH-ïåðåìåòèëáåíçгидриламин, Хап может быть частично или полностью удален с помощью TFAобрабоТки, используемой для деблокирования с(-аминозащитной группы.

Для расщепления и удаления защиты

5,4 r защищенной пептидосмолы обрабатывают с помощью 1,5 мл анизола, 095 мл метилэтилсульфида и 15 мл фтористого водорода (НГ) на 1 г пептидоо смолы при -20 С в течение получаса о и при О С в течение получаса. После

I4 удаления фтористого водорода в вакууме остающийся смолопептид промывают чередованием сухого диэтилового эфира и хлороформа, затем пептид экстрагируют. 2N дегазированной уксусной кислотой получают 2,84 r (путем фильтрования).

Расщепленный и лишенный защиты пептид после этого растворяют в 0-5Х уксусной кислоты и подвергают очистке, которая может включать ультрагель-фильтрацию на "Сефадекс-50", получают 204,4 мг.

Затем пептид очищают препаративный ЖХВД . Кассеты, устанавливаемые. на препаративном жидкостном хроматографе LC-500 производства фирмы

"Уотерс ассошиэйтс" набивают двуокисью кремния типа С -Silica 1520 мкм (фирма "Вайдэк") (300А).

Градиент CH>CN в TEAP создают с помощью грациентного аппарата Элдекс" низкого давления, хроматографические фракции тщательно контролируют с помощью ЖХВД и собирают лишь те, для которых характерна существенная чистота. Высаливание очищенных фракций, независимо проверенных на чистоту, осуществляют с использованием кассет

15-20 мкм С-18 и 15-20 мкм фенил и градиента СН СН в О,IX TFA. Центральная фракция затем подвергалась лиофильной сушке, получают 89,2 мг целевого пептида, чистота которого превышает 98 .

Пример 2. Синтез пептида (Ш.еи2 Nle "jhpGRF(1-29)ÌÍ2, Н, Tyr-Ala-Авр-А1а-Lle-Phe-Thr-Asn.-SerTyr-Arg-Lys-Val-Leu-Gly-Gln-Leu-SerAla-Аг -Lys-Leu-DLeu-His-С1п-Tle-HleSer.-Arg-NHy осуществляют методом последовательных стадий с использованием пептидного синтезатора "Бекман

990" на смоле МВНА по примеру i.

Судя по данным TLC и .HPLC, пептид получен существенно чистым, выход

165 мг (Ы) 2 =-53,3 (С=1, уксусная кислота).

Пример 3. В этих же условиях получены пептиды: (DI.eu »,Nle 2 g

27

rGRf (1-29) NH2 . Н-H is-Ala-Asp-Ala-I l ePhe-Thr-Ser-S er-Ty r-Аrg-Arg- T1 å-Leu Gly-Gln-DLeu-Tyr-Ala-Arg-Lys-LeuDLeu-His-Gln-J1е-N1е-Asn-ArgNHq, выход 226,7 мг, (elj =-51,2 (С=1, уксусная кислота). TLC u HPLC подтвердили чистоту пептида.

35157

4 ((Н 1и, N I » j )»ПСЕ Е(I — 29) 1Щ :

HTуг — Л1,»-A р-ЛI;» — Т1с-I 1»e-Thr-AsnS«r-Ту г-Arg-1,у s-Ч-» I -I,«и-Г ly-Г I n-I.euSe r-A1. а-А» g-l,у s-i,eu-1.еи-(1 и-ОГ1и-1 1. eN1е-Ser-Аг ;1 II2, выход 204,4 мг, (с 7 7» =-50,0 (С=1, уксусная кислота) . (N2MeTyr DGln2 jrhGrF(1-29)NH2.

Ы leTyr.-Alа — Asр-Alа-IIе-Phe-Thr-SerSer-Tyr-Аrg-Arg-Ile-Leu-Gly-Гln-1.еиTyr-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-His-DG1nlle-Met-Asn-ArgNH выход 52 мг, 2 (с 12, = — 51,7 (С=I, уксусная кислота).

Данные TLC u HPLC подтвердили сущест15 венную чистоту пептида.

Для определения эффективности пою лучснных синтетических пептидов в промотировании выделения гормона роста были осуществлены испытания in

2р vitrî с использованием синтетического

hpGRF(1-40)-ОН в качестве стандарта.

Испытывались пептиды в эквимолярных концентрациях. Применяемые культуры включали клетки гипофиза крысы, уда25 ленного за 3-5 дней до эксперимента.

Для сравнительных испытаний использовали культуры, которые считаются оптимальными для секреции гормона роста.

30 Инкубирование с испытуемым веществом проводили в течение 3-4 ч, аликвоты культуральной среды отбирали и переносили для измерения их содержимого в иммуноактивный GH(ir GH) и

35 проводили испытания хорошо-охарактеризованным радиоиммунным способом.

Результаты этого сравнения с

hpGRF(1-40)OH для эквимолярных концентраций представлены в таблице.

Испытания in »itro этих синтетических пептидов показывают, что каждый из них проявляет полную внутреннюю биологическую активность hpGRF (1 — 40)-ОН.

Максимально эффективная концентрация для (DLeu2,Nlå ) hpGRF(1—

23 27

29)NH2 1 нмоль.

В дополнение к испытаниям in vitro цля секреции гормона роста провели

50 эксперименты in vivo введением синтетических пептидов через вживленный катетер в свободно двигающегося нор-мально 2амца крысы после предварительной обработки их FLA-63, ингибитора допамин гидроксилазы, который подав55 ляет спонтанную секрецию GH без воздействия на реакцию к экзогенному

GRF. Через тот же катетер сразу же, через 5 и 20 мин после введения быпи

Формула из обретения

Способ получения пептидов общей формулы I

К -Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-R—

1 9

Ser-Tyr-Arg-R 2-R<, -Leu-Gly-Gln-R.

И О 17

R <>-Аlа-Arg-Lys-Leu-R -R -Р -Ile 2> 24 23

Nle-Rgg -Arg-NH2, К -N ÌåÒó г, H i s; где К8 Ser Asn

К вЂ” Arg,Lys

К, — Ile,Val

К вЂ” Leu или DLeu

К Е вЂ” Тугэяег

К2з- Leu или D-Ьеи

R2<- His,Gln

R2 - G1n,РС1п или Asp

R2ю — Asn, Ser

40

5 14351 взяты образцы крови. Уровни GH в крови, измеренные радиоиммунологическн, показывают, что синтетические чепти" ды, полигенные в условиях способа, являются мощными стимуляторами секреции гипофизной GH и, кроме того, проявляют более длительное действие.

Другие известные тесты GRF in vivo, которые являются эффективными для об" 10 наружения секреции GH, использовали для подтверждения этих результатов. Рассматривали дозы от 100 кг до 50 мкг этих пептидов на кг живого веса," которые являются эффективными в воздействии на СН секрецию. 5

Проведенными испытаниями установлено, что соединение по изобретению относится к категории малотоксичных.

Таким образом, соединения, полученные в условиях данного способа, обладают более высокой активностью в отношении промотирования секреции гормона роста, чем известный промотор

hpGRF(f-40)0H, кроме того, они проявляют более длительное действие.

57 6 ,отличающийся тем, что защищенный ВОС и ТОБ аргинин связывают с метилбензигидриламиновой смолой, защитную ВОС группу отщепляют и проводят постепенное наращивание пептидной цепи в последовательности, соответствующей формуле I, используя

1-2 ммоль защищенной аминокислоты на грамм полимерной смолы, процесс ведут в диметилформамиде, метиленхлориде или их смеси и от полученной при этом пептидной смолы формулы II

Х -R„(Х) или Х2)-Ala-Аяр(Х )-АlаI1e-Phe-Thr(Х )-R<(Х„ или Х ) -Ser(Х ).

Т (Х,)-Arg(X )-Ка (X или X7) R „>

Leu-Gly-С1п(Х ) R» -R» Х 2) -AlaArg(X )-Ьуя(Х7)-Ьеи-К2з К 2 (Х или

Х ) -R2 (Х з)-I 1å-Nle-R ду (Х < или Х +)—

Агд(Х,)-NH-Z, где Х вЂ” водород, ВОС;

Х2 — водород, 2,б-дихлорбензоил;

Х вЂ” водород или 0BZ1

Х вЂ” водород или бензил;

Х вЂ, водород или ксантил;

Xg — водород или тозил;

Х вЂ” водород или 2-хлорбензилоксикарбонил;

Z — ВНА, МЬНА, отщепляют защитные группы и полимерную подложку, обрабатывая пептидилполимер трифторуксусной кислотой или фтористцм водородом при (-.20)б

О С в присутствии анизола и/или мет иленсульфида и целевой продукт выделяют с помощью жидкостной хроматоI графин высокого давления.

Приоритет по п ризнакам ,09.

К,2 -Arg, R» -I l, R» Leu, К» -ТУг, Кд -Leu, R2q;His, Ку-DGlu К и- Ая1

25.10.83 при R„-His, R.<-Ash, Кц2 -Lys, R 1> Val, R,> -DLeu, К 8-Ser, К2З-DLeu, Ку-Glu, R2 -Glu, Asp

К(в -В

in vitro,7. in vivo,÷

Нспытуечые соединения

1. hpGRF(1-40) 100

2,2

2. N МеТчг Mle )rGRF(1—

29) NH

130

3. (П-l.eu < Nl å J hpGRF (129) NN

138

7,2

4. (О-Leu Nle )hpGRF(1— гт

29) NH, 160

6,2

5. (О-G hue Nle 1hpGRF (1—

29) NH

125

5,8

Составитель С.Волкова

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А.Обручар

Редактор О.Спесивых

Заказ 5568/59 Тираж 348 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4